Neue Antigene für die Dengue-Virus Diagnostik durch separate Expression der E-Protein Domänen 1 und 2 - Deniz Lehnert (2016)
Die Gruppe der Dengue-Viren (DENV) ist in vier Serotypen (DENV-1 bis DENV-4) unterteilt. Die meisten Epitope für Dengue-Antikörper bietet das virale Oberflächenprotein E, das aus den drei Proteindomänen ED1, ED2 und ED3 besteht. ED3 wird durch einen kontinuierlichen Genabschnitt bestimmt und kann daher einfach kloniert und als rekombinantes Protein exprimiert werden. Im Gegensatz dazu wird ED1 durch drei und ED2 durch zwei Sequenzabschnitte bestimmt, die nicht kontinuierlich vorliegen. Daher stehen rekombinante ED1- und ED2-Proteine nicht als separate Proteine zur Verfügung. Das Hauptziel dieser Arbeit war die separate Expression der ED1-und eD2-Domänen, um diese in einem serologischen Test einzusetzen. Da im Rahmen von Vorarbeiten die Herstellung reaktiver Antigene für die Serotypen DENV-2 und DENV-4 gelungen war, lag der Fokus dieser Arbeit auf Antigen-Konstrukten für DENV-1 und DENV-3. Zu diesem Zweck wurden verschiedene ED1- und ED2-Konstrukte hergestellt, indem die Sequenzabschnitte der Domänen mit drei Aminosäuren (Gly-Pro-Gly) verknüpft wurden, die ein turn motif bilden. Mit Hilfe von verschiedenen PCR-Methoden wurden zusammengesetzte Sequenzen für ED1 und ED2 erstellt und in das Plasmid pMAL-p4X einkloniert. Die Expression der rekombinanten Proteine erfolgte in E. coli. Die Antigene wurden als MBP-Fusionsprotein exprimiert, wodurch eine Aufreinigung mittels MBPAffinitätschromatografie durchgeführt werden konnte. Die Reaktivität der Antigene wurde mit Patientenseren aus Kolumbien ermittelt. Die Herstellung rekombinanter ED1- und ED2-Antigene der Serotypen DENV-1 und DENV-3 wurde erfolgreich realisiert. Es wurde festgestellt, dass die ED1-Antigene in größeren Mengen als die ED2-Antigene exprimiert werden können. Die Nutzung des Stamms E. coli BL21(DE3) war dabei von Vorteil. Es konnte pro Domäne und Serotyp je ein geeignetes Konstrukt ermittelt werden, welches in großen Mengen hergestellt werden kann und mit Patientenseren intensiv reagiert. Diese Konstrukte können nun als diagnostische Antigene in verschiedenen immunologischen Tests eingesetzt werden.