Untersuchung der Infektiosität von HIV-1 Pseudotypen mit Hüllprotein Chimären humanpathogener Flaviviren

Abstract

In dieser Arbeit wurden Infektionsexperimente mit pseudotypisierten HIV-1-Viruspartikeln durchgeführt. Als Hüllproteine wurden die Proteine prM und E der Flaviviren Usutu, Japanische Enzephalitis (JE) und Zika verwendet. Dafür standen drei Expressionsvektoren pHA-USU-BH65 (Usutu), pHA-JE-NAK (JE) und pHA-Z41519 (Zika) zur Verfügung. Zusätzlich wurden Chimären des E-Proteins mit ausgetauschten ED3-Domänen verwendet. Das E-Protein unterteilt sich in drei Domänen, ED1, ED2 und ED3 wobei die ED3 Domäne leicht austauschbar ist. Für die Expression der Chimären standen vier Plasmide zur Verfügung. Als viralen Vektor wurde das Plasmid pNL Luc AM (Δenv, nef+, Luc+) verwendet. Im ersten Schritt der Arbeit wurde anhand der CsCl-Maxipräparation, Plasmid-DNA von den acht Plasmiden hergestellt. Für die Transfektionsexperimente wurden je Plasmid ca. 5-10 mg Plasmid-DNA aufgereinigt. Die DNA-Lösungen wurden alle auf eine Konzentration von 1 μg/μl eingestellt. Im zweiten Teil wurden pseudotypisierte Viruspartikel durch Transfektion des pNL Luc AM Vektors zusammen mit pHA-prM/E Expressionsvektoren hergestellt. Das Plasmid, pNL Luc AM, codiert für das HIV-1-Genom. Das andere Plasmid codiert für die prM/E-Hüllproteine des entsprechenden Flavivirus bzw. der E-Chimäre. Bei der Transfektion wurde das HIV-1-Vektorplasmid pNL Luc AM zusammen mit jeweils einem der Hüllproteine pHA-USU-BH65, pHA-JE-NAK, pHA-Z41519 sowie den Chimären pHA-U12Z3, pHA-Z12U3, pHA-J12Z3, pHA-Z12J3 der Zika- Usutu- und JE-Viren erfolgreich in HEK293T-Zellen transfiziert. Es wurden jeweils positive Luciferase-Aktivitäten nach Transfektion in den lysierten Zellen gemessen. Im dritten Teil der Arbeit wurden Infektionsexperimente durchgeführt. Dabei wurde die höchste Infektiosität für den Usutu-prM/E Pseudotypen gemessen, gefolgt von Zika-prM/E und dem JE-prM/E Pseudotypen. Bei den Pseudotypen mit den E-Protein Chimären zeigten die Zika/Usutu-Chimären (U12Z3 > Z12U3) eine deutlich höhere Infektiosität als die Zika/JE-Chimären (Z12J3 > J12Z3). Bei den Infektionsexperimenten mit U87- und Hg39-Zellen waren die meisten Messungen im Rahmen der Negativkontrollen. Für die Pseudotypen mit E-Proteinen der Usutu- und Zikaviren, sowie die Pseudotypen mit Z12J3 und J12Z3 E-Protein -Kombinationen wurden signifikante Luciferase-Werte erreicht. Damit konnte gezeigt werden, dass die ED3-Domäne eine wichtige Rolle beim Viruseintritt in U87- und Hg39-Zellen spielt.

In this master's thesis, infection studies were performed using pseudotyped HIV-1 particles. As envelope the prM and E proteins from the three Flaviviruses Usutu, Japanese Encephalitis (JE) and Zika were used. For this study three expression vectors, pHA-USU-BH65 (Usutu), pHA-JE-NAK (JE) and pHA-Z41519 (Zika) were available. Additionally, chimeras of the E-proteins with exchanged ED3 domains were used. The E-protein is divided into the three domains ED1, ED2 and ED3 with the ED3 as the domain that can easily be replaced by an ED3 domain of another flavivirus. For the expression of E-protein chimeras, four plasmids pHA-U12Z3, pHA-Z12U3, pHA-J12Z3 and pHA-Z12J3 were available and used. The viral vector used was the pNL Luc AM plasmid (Δenv, nef+, Luc+). First of all, of all eight plasmids DNA was purified by the CsCl-method. For the transfection experiments 5-10 mg of plasmid-DNA was purified from each of the plasmids. The final concentration was adjusted to 1 μg/μl each. Secondly, pseudotyped HIV-1 was produced by transfection of the pNL Luc AM vector together with one of the pHA-prM/E expressing vectors. The plasmid pNL Luc AM codes for the HIV-1 genome, gag and pol. The other plasmid codes for the prM/E envelopes of the respective E-protein or the respective E-chimera. The transfection of HEK293T cells was successful for pNL Luc AM in all combinations with pHA-USU-BH65, pHA-JE-NAK, pHA-Z41519 as well as the chimeras pHA-U12Z3, pHA-Z12U3, pHA-J12Z3, pHA-Z12J3 of the Zika- Usutu- and Japanese Encephalitis viruses. For all combinations, positive Luciferase activities were measured in the lysed HEK293T cells on day three after transfection. Thirdly, pseudotyped viruses were used for infection experiments. The highest infection rates were observed for the Usutu-prM/E pseudotype followed by the Zika-prM/E and the JE-prM/E pseudotype. For pseudotypes containing the E-protein chimeras, the Zika/Usutu-chimera (U12Z3 > Z12U3) showed higher infection rates compared to the Zika/JE-chimeras (Z12J3 > J12Z3). For the infection experiments using U87 and Hg39 cells, most of the experiments showed infection rates similar to the controls. For pseudotyped viruses containing E-proteins of the Usutu and Zika viruses as well as the pseudotypes with Z12J3 and J12Z3 E-Protein combinations, significant Luciferase values above the controls were obtained. Therefore, a role for the ED3 domain for viral entry into U87 and Hg39 cells was shown.