Construction of fluorescent sensor molecules for the detection of local concentrations of extracellular ATP

Abstract

Adenosine triphosphate (ATP) is known as the universal energy carrier of living cells. In addition, ATP plays an important role as a paracrine and autocrine signalling molecule. The release of ATP is involved in many biological processes such as the regulation of the immune system and inflammatory responses, but ATP also has an important function as a neurotransmitter. Since the ATP concentrations relevant for these processes are in the nanomolar range at the cell surface, measuring them is a technical challenge. The luciferin-luciferase system is the most used assay for measuring ATP concentrations. However, only global concentration changes are detected. The small molecule ATP sensors used in this work are recruited to the cell surface and immobilized there, making it possible to detect local ATP concentrations by live cell imaging. The aim of the work was to construct fluorescent sensor molecules for the detection of local concentrations of extracellular ATP. For this purpose, first the ordered sequences of the GFP-based sensors TP1170_HHM1.1 and TP1170_HHM1.1_RRKK, as well as of ATPOS, were cloned, expressed in bacteria and finally purified. ATPOS was coupled with the dye Cy3 via a maleimide bond. Different strategies were followed to bring the sensor molecules to the cell surface. The two GFP-based sensors are fusion proteins from the ATP sensor iATPSnFR1.1 (HHM1.1) constructed by Lobas et al. (2019) and the TP1170 nanobody developed by Pleiner et al. TP1170 specifically binds the κ light chain of mouse antibodies. To couple TP1170_HHM1.1 or TP1170_HHM1.1_RRKK to the cell membrane, cells were coated with mouse antibodies recognized by TP1170. To bring the ATPOS sensor developed by Kitajima et al. (2020) close to the cell surface, the sensors were bound to streptavidin-coated beads via a biotinylated nanobody directed against ATPOS’ ALFA tag. The beads were also loaded with an antibody directed against a cell surface antigen. Flow cytometry and confocal microscopy confirmed the coupling of sensor and cell and bead, respectively. The function as an ATP sensor could be demonstrated for ATPOS in solution. For the validation of TP1170_HHM1.1 and TP1170_HHM1.1_RRKK further investigation is necessary. Further engineering of these sensors will allow measurement of physiologically relevant concentrations of ATP and visualization of ATP release from target cells, like activated immune cells.

Adenosintriphosphat (ATP) ist als universeller Energieträger lebender Zellen bekannt. Zudem spielt ATP eine wichtige Rolle als parakrines und autokrines Signalmolekül. Die Freisetzung von ATP ist an vielen biologischen Prozessen wie der Regulation des Immunsystems und von Entzündungsreaktionen beteiligt, aber auch als Neurotransmitter hat ATP eine wichtige Funktion. Da die für diese Prozesse relevanten ATP-Konzentrationen an der Zelloberfläche im nanomolaren Bereich liegen, stellt ihre Messung allerdings eine technische Herausforderung dar. Das Luziferin-Luziferase-System ist das am weitesten verbreitete Assay zur Bestimmung von ATP-Konzentrationen. Jedoch werden dabei nur globale Konzentrationsänderungen detektiert. Die in dieser Arbeit verwendeten niedermolekularen ATP-Sensoren werden an die Zelloberfläche gebracht und dort immobilisiert, wodurch es möglich ist, lokale ATP-Konzentrationen mittels Live-Cell-Imaging zu detektieren. Ziel der Arbeit war die Konstruktion fluoreszierender Sensormoleküle zur Detektion lokaler Konzentrationen von extrazellulärem ATP. Dazu wurden zunächst die bestellten Sequenzen der GFP basierten Sensoren TP1170_HHM1.1 und TP1170_HHM1.1_RRKK, sowie von ATPOS kloniert, in Bakterien exprimiert und schließlich aufgereinigt. ATPOS wurde mit dem Farbstoff Cy3 über eine Maleimidbindung gekoppelt. Um die Sensormoleküle an die Zelloberfläche zu bringen, wurden verschiedene Strategien verfolgt. Die beiden GFP basierten Sensoren sind Fusionsproteine aus dem von Lobas et al. (2019) konstruierten ATP-Sensor iATPSnFR1.1 (HHM1.1) und dem von Pleiner et al. entwickelten TP1170 Nanobody. TP1170 bindet spezifisch die κ leichte Kette von Mausantikörpern. Um TP1170_HHM1.1 bzw. TP1170_HHM1.1_RRKK an die Zellmembran zu koppeln, wurden die Zellen mit Mausantikörpern beschichtet, die von TP1170 erkannt wurden. Um den von Kitajima et al. (2020) entwickelten Sensor ATPOS in die Nähe der Zelloberfläche zu bringen, wurde der Sensor über einen biotinylierten, gegen ATPOS‘ ALFA Tag gerichteten, Nanobody an Streptavidin-beschichtete Beads gebunden, die zusätzlich mit einem gegen ein Zelloberflächenantigen gerichteten Antikörper beladen waren. Durchflusszytometrie und konfokale Mikroskopie bestätigten die Kopplung von Sensor und Zelle bzw. Bead. Die Funktion als ATP-Sensor konnte für ATPOS in Lösung nachgewiesen werden. Zur Validierung von TP1170_HHM1.1 und TP1170_HHM1.1_RRKK sind noch weitere Untersuchen notwendig. Die Weiterentwicklung dieser Sensoren wird künftig die Messung physiologisch relevanter ATP-Konzentrationen und somit auch die Visualisierung der ATP-Freisetzung von Zielzellen wie aktivierten Immunzellen ermöglichen.