Herstellung und Analyse einer ddRAD-Bibliothek von Gampsocleis glabra

Abstract

In dieser Bachelorarbeit wurde eine ddRAD-Bibliothek (double digest reactions-site associated DNA) hergestellt, um die Heideschrecke Gampsocleis glabra populationsgenetisch zu analysieren. Das Ziel ist es, eine Aussage zu treffen, ob sich der Genotyp, der isoliert vorkommenden Heideschrecke verändert hat, so dass sich neue Populationen gebildet haben. Dafür wurden Proben aus Deutschland (Klietz, Munster, Rheinmetall), Niederlande, Slowakei und Ungarn untersucht. Das Protokoll für die Herstellung der ddRAD-Bibliothek wurde neu zusammengestellt, deswegen ist ein weiteres Ziel dieser Arbeit das Protokoll qualitativ zu untersuchen, ob es für die Analyse in der Populationsgenetik eingesetzt werden kann und um es weiter zu verbessern. Eine ddRAD-Bibliothek ist eine DNA-Bibliothek, die es ermöglicht, mehrere DNA-Fragmente von Proben, die durch eine Digestion mit zwei Restriktionsenzymen entstehen, mit unterscheidbarem Adapter und Primer (Barcode, Index) und einer NGS-Sequenzierung populationsgenetisch zu untersuchen. Es wird eine ddRAD-Bibliothek eingesetzt, weil sie kostengünstiger, effizienter und mehr genetische Informationen bzw. Polymorphismen erzeugt als anderen Methoden z.B. „SNP-Chips“. Für die Beantwortung der Fragen wurden zwei ddRad-Bibliotheken hergestellt, jeweils mit 24 Proben aus unterschiedlichen Fundorten. Für die Herstellung wurde die Restriktionsenzyme SbfI und MseI für die Digestion eingesetzt. Die Unterscheidung der Proben wurde mit den spezifischen Adaptern und Primern für die Illumina-NGS-Sequenzierung gewährleistet. Die Fragmentierung erfolgte mit magnetischen Beads und BluePippin. Jeder Schritt der Herstellung wurde mit dem Elektrophorese-System Tapestation kontrolliert. Die Sequenzierung wurde mit eine Illumina MiSeq durchgeführt. Die bioinformatische Bearbeitung und Vorbereitung der Reads erfolgte mit den Programmen STACKS und CUTADAPT. Anschließend wurde mit STRUCTURE und STRUCTURE HARVESTER die Populationsstruktur bestimmt. Dabei wurden jeweils die beiden einzelnen Bibliotheken und eine Zusammenführung der Daten der beiden Bibliothek analysiert. Die Analyse der Qualität wurde mit dem Programm FASTQC und MULTIQC durchgeführt. Die Einstellungen des Programms wurde so konzipiert, dass sie eine Schnellanalyse möglich macht. Die beiden Bibliotheken sind nach dem Phred-Qualität-Wert, der für die meisten Sequenzen zwischen 30 und 35 liegt, für die Populationsgenetik einsetzbar. Die einzelnen Bibliotheken haben Anteile von drei Populationen, die zusammengeführten Daten habe Anteile von vier Populationen im Genotyp. Es hat sich gezeigt, dass die Aussagen der drei Populationsstrukturen nicht einheitlich sind und durch die stochastische Bearbeitung (MCMC, Ad-hoc-Statistik) nicht vergleichbar sind. Für eine bessere Aussage über eine Populationsstruktur müsste die ddRAD-Bibliothek um mehrere Proben aus verschiedenen Fundorten vergrößert werden, die pro Ort die gleiche Anzahl haben.