Expression, purification and biophysical characterization of SARS-CoV-2 non-structural protein 6

Abstract

The non-structural protein 6 (nsp6) is a membrane spanning protein and expressed by ORF1a of SARS-CoV-2. Nsp6 is likely to be involved in membrane anchoring of the replication complex but also to induce the formation of membrane structures to have impact on autophagy inhibition. It is predicted, that Nsp6 has a secondary structure consisting of alpha helices that span the lipid bilayer by 6 transmembrane domains and to have 3 luminal loops. Nsp6 has been shown to induce autophagosome formation from host ER and to have an inhibitory effect on lysosomal acidification through the interaction with ATP6AP1, causing autophagic flux stagnation to evade lysosomal degradation. Co-expression of Nsp3, Nsp4, and Nsp6 led to the formation of DMVs, in which Nsp6 mediate the association of DMVs with LDs and acts as a connector between the zippered ER and DMVs, in which it allows lipid flow but prevents access of ER proteins. In this work, Nsp6 was expressed into nanodiscs using a cell free expression system followed by purification using Ni-NTA affinity chromatography and size exclusion chromatography. The aim of this thesis was to characterize the primary, secondary and tertiary structure of Nsp6 using different biophysical methods. In vitro expression and purification of Nsp6 using nanodiscs of different sizes was successful allowing the characterization of primary, secondary and tertiary structure. It could be shown, that Nsp6 has a molecular size of around 34 kDa using MALDI-TOF mass spectrometry. Besides, mass photometry analysis revealed empty nanodiscs to have a higher molecular weight than Nsp6-MSP1E3D1-POPC complexes. Secondary structure analysis via CD spectroscopy confirmed the expected alpha helical structure. Deconvolution after subtraction of nanodisc from Nsp6-MSP2N2-POPC complex signal showed 75 % helical structure, whereas the alpha-fold model predicts 74 % helical and 4 % beta-structure. Tertiary structure analysis using fluorescence spectroscopy for tryptophan excitation revealed an emission maximum at 335 nm as expected for buried tryptophane residue in a properly folded protein. A higher fluorescence intensity of tyrosine and tryptophan compared to tryptophan fluorescence intensity, proved that not all tyrosine fluorescence is quenched by tryptophan, which indicates a high average distance between tryptophan and tyrosine in the protein structure.

Das non-structural Protein 6 (Nsp6) ist ein membranspannendes Protein, welches vom ORF1a des SARS-CoV-2 exprimiert wird. Es ist wahrscheinlich, dass Nsp6 an der Membranverankerung des Replikationskomplexes beteiligt ist, aber auch die Bildung von Membranstrukturen induziert, die einen Einfluss auf die Autophagiehemmung haben. Es wurde vorhergesagt, dass Nsp6 eine Sekundärstruktur von Alpha-Helices hat, die die Lipiddoppelschicht durch sieben Transmembrandomänen durchspannen und 3 luminale Schleifen besitzen. Es wurde gezeigt, dass Nsp6 die Bildung von Autophagosomen aus dem ER des Wirts induziert und durch die Wechselwirkung mit ATP6AP1 eine hemmende Wirkung auf die lysosomale Ansäuerung hat, wodurch eine Stagnation des autophagischen Flusses verursacht wird, um dem lysosomalen Abbau zu entgehen. Die Koexpression von Nsp3, Nsp4 und Nsp6 führte zur Bildung von DMVs, in denen Nsp6 die Assoziation von DMVs mit LDs vermittelt und als Bindeglied zwischen dem Reißverschluss-ER und den DMVs fungiert, in denen es den Lipidfluss ermöglicht, aber den Zugang von ER-Proteinen verhindert. In dieser Arbeit wurde Nsp6 unter Verwendung eines zellfreien Expressionssystems in Nanodiscs exprimiert, gefolgt von einer Aufreinigung unter Verwendung von Ni-NTA Affinitätschromatographie und Größenausschlusschromatographie. Das Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung der Primär-, Sekundär- und Tertiärstruktur von Nsp6 durch Verwendung verschiedener biophysikalischer Methoden. Die In-vitro Expression und Aufreinigung von Nsp6 unter Verwendung von Nanodiscs unterschiedlicher Größe war erfolgreich und die Charakterisierung der Primär-, Sekundär- und Tertiärstrukturanalyse wurde durchgeführt. Mittels MALDI-TOF Massenspektrometrie konnte gezeigt werden, dass Nsp6 eine Molekülgröße von etwa 34 kDa hat. Außerdem ergab die massenphotometrische Analyse, dass leere Nanodiscs ein höheres Molekulargewicht als Nsp6-MSP1E3D1-POPC Komplexe aufweisen. Eine Sekundärstrukturanalyse mittels CD-Spektroskopie bestätigte die erwartete alpha-helikale Struktur des Nsp6. Dekonvolution nach Subtraktion des Nanodisc Sinals vom Signal des Nsp6-MSP2N2-POPC Komplexes zeigte 75 % helikale Struktur, während das AlphaFold Modell 74 % helikale und 4 % beta-Struktur vorhersagt. Eine Tertiärstrukturanalyse unter Verwendung von Fluoreszenzspektroskopie zur Tryptophananregung ergab ein Emissionsmaximum bei 335 nm, wie es für einen verdeckten Tryptophanrest erwartet wurde. Eine höhere Fluoreszenzintensität von Tyrosin und Tryptophan im Vergleich zur Tryptophan Fluoreszenzintensität bewies, dass nicht die gesamte Tyrosin-Fluoreszenz durch Tryptophan gelöscht wird, was auf einen hohen durchschnittlichen Abstand zwischen Tryptophan und Tyrosin in der Proteinstruktur hinweist.