| Zusammenfassung: | Adenosintriphosphat (ATP) ist ein essenzielles Molekül, das neben seiner intrazellulären Funktion als Energiespeicher auch extrazellulär als Signalmolekül bei verschiedenen physiologischen Prozessen wie Zellatmung, Photosynthese und DNA-Synthese wirkt. Da die für diese Prozesse relevanten ATP-Konzentrationen an der Zelloberfläche im oberen nanomolaren Bereich liegen, stellt deren Messung eine tech... Adenosintriphosphat (ATP) ist ein essenzielles Molekül, das neben seiner intrazellulären Funktion als Energiespeicher auch extrazellulär als Signalmolekül bei verschiedenen physiologischen Prozessen wie Zellatmung, Photosynthese und DNA-Synthese wirkt. Da die für diese Prozesse relevanten ATP-Konzentrationen an der Zelloberfläche im oberen nanomolaren Bereich liegen, stellt deren Messung eine technische Herausforderung dar. Kitajima et al. (2020) haben einen Protein-basierten fluoreszierenden ATP Sensor (ATP optical sensor, ATPOS) entwickelt, der sich zur Visualisierung von extrazellulärem ATP im submikromolaren Bereich eignet. Allerdings ist die Bindung dieses Sensors an definierte Proteine auf Zelloberflächen schwierig. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es daher, die ATPOS ATP-Sensoren so zu modifizieren, dass sie spezifisch an die Oberfläche von Zellen binden können und damit in der Lage sind, lokale ATP-Konzentrationen durch Bildgebung in lebenden Zellen nachzuweisen. Während dieser Arbeit werden drei ATPOS-basierte Fusionsproteine namens TP1170_alfa_ATPOS, ATPOS_alfa_SBP und ATPOS_Sortase entwickelt, die sowohl in bakteriellen als auch humanen Zellen produziert, aufgereinigt und mit dem Farbstoff Cy3- Maleimid markiert werden. Die erste Variante beinhaltet die Fusion von ATPOS mit dem Nanobody TP1170, der von Pleiner et al. (2018) entwickelt wurde und gegen die Kappa-Kette von Maus-Antikörpern gerichtet ist. Dieser Sensor kann so an definierte Proteine auf humanen Zellen herangeführt werden, die vorher mit einem Maus-Antikörper markiert worden sind. Die anderen Varianten stellen zwei Möglichkeiten dar, die Bindung von ATPOS an Streptavidin zu vermitteln. In dem einen Fall wird ATPOS an das Streptavidin-bindende Peptid (SBP) fusioniert, im anderen Fall mit einem Sortase-tag versehen, welcher eine enzymatisch vermittelte, präzise lokalisierte Biotinylierung ermöglicht. Um diese beiden Varianten an die Zellen zu binden, werden sie an Streptavidin gekoppelt. Da Streptavidin über vier Biotin- Bindungsstellen verfügt, kann das mit ATPOS beladene Streptavidin über einen biotinylierten Antikörper, der auf der Zielzelle sitzt, an die Zelloberfläche herangeführt werden. Schließlich wird die Bindung der TP1170- und SBP-Fusionsproteine an Zellen bzw. an Streptavidin-Beads mittels Durchflusszytometrie und Mikroskopie untersucht, und erste Versuche zum Einsatz der Sensoren im Live-Cell Imaging werden unternommen.
Adenosine triphosphate (ATP) is an essential molecule that, besides its critical intracellular role as "energy currency" of the cell also plays a crucial role extracellularly as a signaling molecule in various physiological processes such as cellular respiration, photosynthesis, and DNA synthesis. Since the cell surface ATP concentrations relevant to these processes are in the nanomolar to low mic... Adenosine triphosphate (ATP) is an essential molecule that, besides its critical intracellular role as "energy currency" of the cell also plays a crucial role extracellularly as a signaling molecule in various physiological processes such as cellular respiration, photosynthesis, and DNA synthesis. Since the cell surface ATP concentrations relevant to these processes are in the nanomolar to low micromolar range, measuring them is a technical challenge. Kitajima et al. (2020) have developed a protein-based fluorescent ATP sensor (ATP optical sensor, ATPOS) that is suitable for the visualization of extracellular ATP in the submicromolar range. However, targeting this sensor to defined proteins on cell surfaces is difficult. The aim of this study is therefore to modify the ATPOS ATP sensors to specifically bind to the surface of cells and thus be able to detect local ATP concentrations by imaging in living cells. During this study, three ATPOS-based fusion proteins named TP1170_alfa_ATPOS, ATPOS_alfa_SBP, and ATPOS_Sortase will be developed, produced in both bacterial and human cells, purified, and labeled with the dye Cy3-maleimide. The first variant involves the fusion of ATPOS with the TP1170 nanobody, developed by Pleiner et al. (2018), which targets the kappa chain of mouse antibodies. This sensor can thus be targeted to defined proteins on human cells that have previously been marked with a mouse antibody. The other variants represent two strategies for coupling the sensor to streptavidin. In one case ATPOS is fused to the streptavidin-binding peptide (SBP), in the other case it is fused to the Sortase-tag, which enables the enzyme-mediated site-specific biotinylation of the sensor. To bind these two variants to cells, they are first coupled with streptavidin. Since streptavidin has four biotin binding sites, the ATPOS/streptavidin complex can be targeted to cells via a biotinylated antibody directed against a cell surface molecule. Finally, the binding of the TP1170- and SBPcontaining ATP protein sensors to cells or streptavidin-coated beads will be investigated by flow cytometry and microscopy, and first attempts will be made to examine the suitability of the sensors in live cell imaging experiments. |
