Charakterisierung eines Oberflächenproteins Plasmodium falciparum infizierter Erythrozyten (PfEMP1_IT4_var16), welches die Bindung an verschiedene Endothelrezeptoren vermittelt

Abstract

Die Plasmodium-Arten sind die Erreger der Malaria. Vor allem Plasmodium falciparum (P. falciparum) ist für die schweren Verläufe der Malaria verantwortlich. Dieser besitzt die Fähigkeit, einen von ihm infizierten Erythrozyten umzubauen und verschiedene Strukturen auszubilden. So werden auf der Oberfläche eines infizierten Erythrozyten knobs ausgebildet. In diesen knobs befinden sich spezielle Proteine aus der Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 (PfEMP1) -Familie, mit denen sich der infizierte Erythrozyt an Endothelzellen anhaften kann. Dies wird Zytoadhärenz genannt. Dabei kann es zu den schweren Symptomen der Malaria wie beispielsweise Organversagen oder der zerebralen Malaria kommen. Das geschieht, weil der Blutfluss in den kleinsten Blutgefäßen durch die Zytoadhärenz erheblich gestört werden kann. Die Zytoadhärenz ist eine Strategie des Parasiten, den Durchgang durch die Milz zu vermeiden. Dort würde dieser vom Immunsystem erkannt und zerstört werden. Über PfEMP1 erfolgt die Bindung an Endothelrezeptoren, die sich auf den Endothelzellen befinden. Für das Verständnis der Pathogenität von P. falciparum ist es von Wichtigkeit, diese Bindungen zwischen den PfEMP1-Proteinen und den Endothelrezeptoren zu charakterisieren. In dieser Arbeit wurde mit einer IT4-SLI-var16-Transfektante gearbeitet. Die Kultur einer solchen Transfektante exprimiert fast ausschließlich das var16-Gen. Die var-Gene kodieren für die unterschiedlichen PfEMP1s, von denen es pro Isolat etwa 60 verschiedene gibt. Normalerweise wechselt die Expression der var-Gene zu einem kleinen Teil nach jedem Durchlauf des asexuellen Lebenszyklus von P. falciparum. Mit der selection-linked integration-Methode (SLI) wird an das gewünschte var-Gen ein Resistenzgen über homologe Rekombination angefügt. Unter einem erzeugten Selektionsdruck können nur die Parasiten überleben, die das gewünschte var-Gen exprimieren. Es wurde die Bindung von var16_PfEMP1 an verschiedene Endothelrezeptoren in statischen Bindungs-Assays mit Hilfe von transgenen CHO-745-Zellen untersucht, die den jeweiligen Rezeptor auf ihrer Oberfläche präsentieren. Dabei wurden die Rezeptoren CD36, ICAM-1, TNFR2 und VCAM-1 als bekannte Bindungspartner von var16_PfEMP1 verifiziert. Für MDR1, EPCR, TNFR1, CD9, CD37 und CD81 konnte keine signifikante Bindung festgestellt werden. Ein neuer Bindungspartner mit CD55 wurde für var16_PfEMP1 gefunden. In einem Inhibitions-Assay wurde versucht, die Bindung zwischen var16_PfEMP1 und dem Endothelrezeptor ICAM-1 zu hemmen. Dazu wurde ein ICAM-1-Antikörper eingesetzt. Die Hemmung war jedoch nicht erfolgreich. Grund hierfür könnte sein, dass der eingesetzte Antikörper ein monoklonaler Antikörper war. Dieser bindet an nur ein Epitop von ICAM-1. Hier wäre für zukünftige Experimente ein polyklonaler Antikörper wahrscheinlich besser geeignet.

Plasmodium species are the causative agents of malaria. Plasmodium falciparum (P. falciparum) in particular is responsible for the severe courses of malaria. The latter has the ability to remodel an erythrocyte infected by it and to form various structures. Knobs are formed on the surface of an infected erythrocyte. These knobs contain special proteins from the Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1 (PfEMP1) family, which allows the infected erythrocyte to attach to endothelial cells. This process is called cytoadherence. It can lead to the severe symptoms of malaria such as organ failure or cerebral malaria. These symptoms appear as blood flow in the smallest blood vessels can be significantly disrupted by cytoadherence. Attachment to endothelial cells is a strategy of the parasite to avoid passing through the spleen, as it would be recognized and destroyed by the immune system. Via PfEMP1, binding occurs to endothelial receptors located on endothelial cells. To understand the pathogenicity of P. falciparum, it is important to characterize these bindings between PfEMP1 proteins and endothelial receptors. In this work, an IT4-SLI-var16 transfectant has been used. The culture of such a transfectant expresses almost exclusively the var16 gene. The var genes encode the different PfEMP1s, of which there are about 60 different ones per isolate. Usually, the expression of the var genes switches to a small extent after each run of the asexual life cycle of P. falciparum. Using the selection-linked integration method (SLI), a resistance gene is added to the desired var-gene via homologous recombination. Under a generated selection pressure, only parasites expressing the desired var-gene can survive. The binding of var16_PfEMP1 to different endothelial receptors has been investigated in static binding assays using transgenic CHO-745 cells presenting the respective receptor on their surface. The receptors CD36, ICAM-1, TNFR2, and VCAM-1 were verified as known binding partners of var16_PfEMP1. No significant binding was detected for MDR1, EPCR, TNFR1, CD9, CD37 and CD81. A new binding partner with CD55 has been found for var16_PfEMP1. An inhibition assay was performed in an attempt to inhibit binding between var16_PfEMP1 and the endothelial receptor ICAM-1. An ICAM-1 antibody has been used for this purpose. However, the inhibition was not successful. Using a monoclonal antibody could be the reason for this result. A polyclonal antibody would probably be more suitable for future experiments.