Klonierung und Expression von Mutanten des 20S-Proteasoms aus Thermoplasma acidophilum zur Untersuchung der Substrattranslokation

Abstract

Der 20S-Proteasom ist ein wesentlicher Bestandteil des Proteasomsystems und verantwortlich für den Abbau fehlgefalteter, beschädigter oder überflüssiger Proteine in Zellen. Er besteht aus mehreren Untereinheiten, die eine faßförmige Struktur mit proteolytisch aktiven Stellen im Inneren bilden. In Thermoplasma acidophilum, einem extremophilen Archaeon, spielt der 20S-Proteasom eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der zellulären Proteinhomöostase unter extremen Umweltbedingungen. Zentrale Funktion des Proteasoms ist die Substrattranslokation, bei der zu degradierende Proteine entfaltet und in die proteolytische Kammer transloziert werden. Der 20S-Proteasom von T. acidophilum besteht aus vier heptameren Ringen, von denen jeder sieben Proteinuntereinheiten enthält. Die äußeren Ringe bestehen aus identischen alpha-Untereinheiten, während die inneren Ringe aus identischen beta-Untereinheiten bestehen. Diese Anordnung schafft eine zentrale Kammer, in der die Proteolyse stattfindet. Der eigentliche Prozess der Proteolyse im 20S-Proteasomkern erfolgt ATP-unabhängig. Die strukturelle Komplexität dieser Untereinheiten ist entscheidend für die Stabilität des Proteasoms und seine Fähigkeit, unter extremen Bedingungen zu funktionieren. [1] Obwohl die Struktur des Proteasomkomplexes gut erforscht ist, ist wenig über die Translokation seiner Substrate durch die Pore, die von den α-Untereinheiten gebildet wird, in die Vorkammern und schließlich in die zentrale Kammer, in der die Proteolyse stattfindet, bekannt. Auch die Regulation, die dem Prozess der Substrattranslokation zugrunde liegt, ist weitgehend unbekannt. Um die Mechanismen der Substrattranslokation durch das 20S-Proteasom zu untersuchen, wurden spezifische Mutanten der Untereinheiten des 20S-Proteasoms von Thermoplasma acidophilum entwickelt. Diese Mutanten zielten darauf ab, gezielt Bereiche zu verändern, die an der Substrattranslokation beteiligt sind. Mithilfe der QuikChange™-Mutagenese wurden gezielte Mutationen in die DNA-Sequenzen eingeführt, die diese Untereinheiten kodieren. Die mutierten Gene wurden anschließend in den pRSF-Vektor kloniert und in Escherichia coli BL21(DE3)-Zellen exprimiert. Die Ergebnisse der Klonierung und der Expression dieser spezifischen Mutanten des 20S-Proteasoms von Thermoplasma acidophilum bilden eine wertvolle Grundlage für weitere Studien. Diese könnten zur Aufklärung der Struktur-Funktions-Beziehung des Proteasomkomplexes beitragen, was wiederum zu einem besseren Verständnis der Substrattranslokation und der Interaktion der Untereinheiten im Ta20S-Proteasom führt.

The 20S proteasome is a crucial component of the proteasome system, responsible for the degradation of misfolded, damaged, or unneeded proteins in cells. Comprising of multiple subunits, it forms a barrel shaped structure with proteolytic active sites located within its interior. In Thermoplasma acidophilum, an extremophilic archaeon, the 20S proteasome plays a vital role in maintaining cellular protein homeostasis under extreme environmental conditions. Central to its function is substrate translocation, where proteins targeted for degradation are unfolded and translocated into the proteolytic chamber. The 20S proteasome of T. acidophilum is constructed from four heptameric rings, each containing seven protein subunits. The outer rings are composed of identical alpha subunits, while the inner rings are made up of identical beta subunits. This arrangement creates a central cavity where proteolysis occurs. The actual process of proteolysis in the 20S proteasome core takes place in an ATP-independent manner. The structural complexity of these subunits is essential for the proteasome's stability and its ability to function in extreme environments [1]. In contrast to our detailed knowledge about the structure of the complex, less is known about the translocation of its substrates through the gate formed by the alpha subunits, the antechambers into the central chamber where proteolysis takes place. The regulation underlying the process of substrate translocation is also mostly unknown. To bridge this gap in knowledge, specific mutants from the subunits of the 20S proteasome from Thermoplasma acidophilum were designed. These mutants were created to specifically alter regions thought to be involved in substrate translocation. Using QuikChange™ mutagenesis, targeted mutations were introduced into the DNA sequences encoding these subunits. The mutated genes were then cloned into the pRSF vector and expressed in Escherichia coli BL21(DE3) cells. The results of cloning and expressing specific mutants of the 20S proteasome from Thermoplasma acidophilum provide a valuable foundation for further studies, which could help elucidate the structure-function relationship of the proteasome complex. This, in turn, contributes to a better understanding of substrate translocation and subunit interaction in the Ta20S proteasome.