Optimierung der Produktion und Aufreinigung von Antikörperfragmenten

Abstract

Die Hot-Start-Polymerasekettenreaktion (Hot-Start-PCR) ist eine gängige Methode in der diagnostischen Molekularbiologie zum Nachweis von Krankheitserregern. Damit unspezifische Produkte minimiert werden, werden DNA-abhängige DNA-Polymerasen mit Antikörpern inhibiert. Durch eine initiale Inkubation bei hoher Temperatur werden die Antikörper denaturiert und die Polymerasen freigesetzt, sodass die Amplifikation beginnen kann. Klassischerweise werden Antikörper mit der Hybridoma-Technologie in Zellkulturen hergestellt, um posttranslationale Modifikationen zu gewährleisten. Zellkulturen bringen einen hohen Kosten- und Zeitaufwand mit sich, weshalb eine Produktion in Escherichia coli (E. coli) bevorzugt wird. Bei der Produktion von rekombinanten Proteinen in E. coli ist die Formation von Inclusionbodies ein weitverbreitetes Phänomen. In Inclusionbodies liegen die Proteine aggregiert, überwiegend fehlgefaltet und ohne biologische Aktivität vor. Nicht immer lässt sich die Aggregation der rekombinanten Proteine verhindern, weshalb verschiedene Methoden zur Gewinnung von nativen Proteinen aus Inclusionbodies entwickelt wurden. Ziel dieser Arbeit war es, ein scFv-Fragment gegen eine DNA abhängige DNA-Polymerase zu produzieren und aufzureinigen. Die scFvs wurden überwiegend als Inclusionbodies produziert, weshalb in dieser Arbeit drei Methoden zur Solubilisierung und Aufreinigung der Antikörperfragmente getestet wurden. Getestet wurden die Solubilisierung durch Solubilisierungsmittel im Lysepuffer, die Solubilisierung durch Fusion eines Löslichkeits-Tags und die Solubilisierung mit Refolding durch ein on-column Refolding. Durch die Fusion mit einem Löslichkeits-Tag, sowie mit dem on-column Refolding konnten die scFv Fragmente erfolgreich aufgereinigt werden. Insbesondere der Löslichkeits-Tag führte zu Fragmenten mit stark gesteigerter Antigenbindung. Problematiken traten bei der Stabilität der Fragmente im Lagerpuffer, sowie bei der Inhibierung der Amplifizierfähigkeit der Polymerase auf. Die Arbeit erbrachte wichtige Erkenntnisse über Problematiken der Produktion von scFv-Fragmenten in E. coli und bietet Ansätze für weiteres Vorgehen.