Entwicklung eines Knockout-Models zur Untersuchung der Rolle der nichtkodierenden kleinen RNA smRC1 unter Verwendung von CRISPR/Cas9 Vektoren

Abstract

Das Hepatozelluläre Karzinom ist eine der tödlichsten Krebsarten weltweit und durch seine schleichende Ent-wicklung erst spät diagnostizierbar. Die Arbeitsgruppe von Felden konnte drei verschiedene kleine, nicht kodierende RNA-Cluster (smRC1, smRC2, smRC3) identifizieren, die aus extrazellulären Vesikeln aus dem Blut von Patientinnen und Patienten mit Hepatozellulärem Karzinom isoliert wurden. Die Funktion dieser RNA-Cluster soll zukünftig untersucht werden und könnte von hoher Bedeutung für die Erkennung und Behandlung des Hepatozellulären Karzinoms sein.1 Der Fokus liegt zunächst auf smRC1, dessen Rolle bereits mit Knockout-Experimenten bei der Zelllinie Huh-7 untersucht wurde. Erst kürzlich konnte festgestellt werden, dass es sich bei smRC1 nicht, wie anfangs angenommen, um eine eigenständige kleine RNA handelt, sondern um einen Teil der langen nicht-kodierenden RNA ENST00000647660. Ziel dieses Projektes ist die Etablierung von smRC1-Knockout-Zellklonen der Zelllinien SNU-475, Hep 3B und PLC/PRF/5. Dafür wurde die Gensequenz von smRC1 mittels lentiviraler Transduktion unter Verwendung von CRISPR/Cas9 Vektoren ausgeknockt. Parallel wurde eine Kontroll-Zelllinie mit dem leeren Vektor SCRAMBLE infiziert. Mit Einzelzellklonierung, Kolonie-Picking und der Klonierung in semisolidem Medium wurden verschiedene Methoden zur klonalen Isolation neuer Zelllinien getestet. Die isolierten Zelllinien wurden mittels DNASequenzierung auf den Knockout untersucht und charakterisiert. Von den Zelllinien PLC/PRF/5 und Hep 3B konnten nach der Transduktion mehrere Kontroll- und Knockout-Zelllinien etabliert werden, während dies bei den neu gewonnenen SNU-475-Zelllinien scheiterte. Die Untersuchung der relativen smRC1-Genexpression mittels RT-qPCR erlaubte keine Differenzierung zwischen den Kontroll-Zelllinien und den Knockoutzelllinien, jedoch wurde durch einen Kolonie-Bildungs-Assay ein geringeres klonogenes Potential der Knockout-Zelllinien im Vergleich mit den Kontroll-Zelllinien festgestellt. Dieses Ergebnis könnte dafür sprechen, dass smRC1 an dem aggressiven Verhalten der Krebszellen des Hepatozellulären Karzinoms beteiligt ist.