Einsatz von Nanopartikeln zur Aufreinigung von Zellorganellen des Rezeptor-Recycling-Weges in CHO-Zellen

Abstract

Aufgrund der steigenden Zahl von Krebserkrankungen in den Industrieländern, nicht zuletzt durch eine zunehmende Lebenserwartung begründet, werden große Hoffnungen in die Entwicklung von neuen Therapiemöglichkeiten gelegt. Entartete Zellen sind durch veränderte Proteinkonzentrationen der Zellmembran gekennzeichnet. Deren Regulierung erfolgt zumeist durch den endocytotischen Recycling-Weg. Hierbei muss geklärt werden, ob die Veränderung der Oberflächenkonzentration membranständiger Proteine durch eine Störung des Recycling Weges verursacht wird, indem an der Krebsentstehung beteiligte Proteine durch die vergleichende Analyse des Subproteoms normaler Zellen und Krebszellen identifiziert werden.

In dieser Arbeit wurde eine Methode zur Isolierung des Recycling Endosoms (RE) aus CHO-Zellen mit Hilfe von magnetischen Nanopartikeln (MNP) entwickelt. Die MNP binden, durch deren Kopplung mit holo-Transferrin (Tfn), an den membranständigen Transferrinrezeptor (TfnR) und werden durch Rezeptorvermittelte Endocytose in die Zelle internalisiert und über den Rezeptor-Recycling-Weg in das RE geführt. Da MNP im Lichtmikroskop nicht direkt detektiert werden können, wurde zunächst eine Methode zur Absorptionsmessung der MNP im Spektralphotometer entwickelt. Dabei standen vier verschiedene MNP-Typen zur Verfügung, die auf ihre Kopplungs- und Internalisierungs-tauglichkeit geprüft wurden. Während sich sowohl die kationisch geladenen MNP als auch die Anti-Biotin-Mikropartikel als ungeeignet erwiesen, zeigten die anionisch geladenen MNP sowie die Dextran-umhüllten Mikropartikel positive Ergebnisse hinsichtlich ihrer Cy3-Tfn-Kopplungs- und Internalisierungs-eigenschaften. Die Partikelinternalisierung wurde mit der Fluoreszenzmikroskopie analysiert. Bevor die Partikel von den Zellen internalisiert werden konnten, erfolgte eine Abtrennung des ungekoppelten Tfn von den Tfn-gebundenen Partikeln, da beide um die Bindungsstellen der TfnR konkurrieren würden. Die Magnetseparation mit Hilfe einer magnetischen Säule stellte sich aufgrund unspezifischer Wechselwirkungen der MNP mit dem Säulenmaterial als nicht durchführbar heraus. Deshalb wurde eine Gelfiltration mit Sepharose 4B entwickelt. Zur Isolierung der RE wurden Tfn-gekoppelte anionische MNP von den Zellen internalisiert. Der durch den Zellaufschluß entstandene PNS wurde über eine magnetische Säule aufgereinigt, wodurch die Endosomen isoliert wurden. Eine anschließende qualitative Analyse der Markerproteinkonzentrationen zeigte eine Anreicherung der TfnR jedoch nicht von Rab4.