DoE gestützte Etablierung und Optimierung der Isolation zellinterner Produkte durch Tangentialflussfiltration mit Hohlfasern aus komplexen E. coli-Lysaten

Abstract

Primäres Ziel der Bachelorarbeit war die Etablierung und Optimierung eines Tangentialfluss-filtrationsverfahrens zur Aufreinigung von verschiedenen E. coli-Lysaten mit Hohlfaserfiltern. Dabei wurde das neue vollautomatische Filtrationssystem ÄKTAcrossflow™ von GE Healthcare eingeführt und das Filtrationsversuchsschema mit einem ausgewählten DoE-Modell aufgestellt und ausgewertet. Als sekundäres Ziel erfolgte während der Bachelorarbeit ein Scale-down der Fermentationen um den Faktor 10 (von 10 Liter auf 1 Liter) und dessen Auswertung, Vergleich und Diskussion. Dazu konnten zwei firmeninterne E. coli Zellstämme erst im Schüttelkolben und dann im 1-L-Maßstab standardmäßig fermentiert und das Wachstumsverhalten charakterisiert werden. Mit jedem der beiden unterschiedlichen rekombinanten Organismen wurde jeweils ein Protein hergestellt, wobei eins als Inclusion Bodies und eins in löslicher Form im Zytoplasma vorliegt. Nach der Fermentation und Zellernte erfolgte ein spezifischer Zellaufschluss, um das rekombinant hergestellte Produkt freizusetzen, und anschließend eine Filtration im Tangentialflussverfahren. Für die Filtration mit Hilfe der neu eingeführten ÄKTAcrossflow™ von GE Healthcare wurden Hohlfasern mit Porengrößen zwischen 500 kDa und 0,1 μm eingesetzt. Zur Untersuchung der Filtrationsleistung erfolgte die DoE-Versuchsplanung mit dem Programm MODDE. Im Rahmen von 13 Versuchen für jedes Projekt wurden erst die grundsätzlichen Eigenschaften der beiden verschiedenen Zelllysate in speziellen Vorversuchen und dann die Filtrationsleistung in Abhängigkeit ausgesuchter Parameter bestimmt. Dabei dienten die Scherrate, der Membranflux und die Porengröße als Eingangsparameter und die Proteinwiederfindungsrate mit Ergänzung der Prozesszeit als Ausgangsparameter. In den Vorversuchen konnte die Diversität der verschiedenen Zelllysate untersucht und diskutiert werden, da zwischen den Zellsuspensionen der beiden Projekte deutliche Unterschiede zu verzeichnen waren. Das System ÄKTAcrossflow konnte erfolgreich in den Prozessverlauf integriert und etabliert werden. Im Rahmen der anschließenden DoE-Auswertung wurde besonders der bedeutende Einfluss der Scherrate deutlich, der in Interaktion mit dem richtigen Membranflux zu Proteinwiederfindungsraten von über 90% führte.