Quantifizierung von Proteinen mittels Aminosäureanalytik

Abstract

Im Zuge dieser Arbeit wird eine Methode entwickelt, um Proteine mittels Aminosäureanalytik zu quantifizieren. Die Austestung erfolgt mit Hilfe von zwei Testproteinen. Die Wahl fiel auf Bovines Serum Albumin (BSA), da es vielfach als Standard für Protein-Assays Verwendung findet sowie das Enzym Lysozym. Es ist wesentlich kleiner als BSA, aber ebenso gut erforscht. Zum Vergleich der Ergebnisse dieser Methode wurde der Bradford-Assay genutzt. Er ist einfach in der Durchführung, wird häufig verwendet und ist wenig störanfällig im Vergleich zu anderen Proteinassays. Um die Aminosäuren analysieren zu können, muss eine Proteinhydrolyse erfolgen. Dafür wird, nach gründlicher Literaturrecherche, eine saure Hydrolyse mit sechs molarer Salzsäure bei 110 °C für 24 h und 48 h gewählt. Die längere Hydrolysezeit erbrachte keine deutliche Verbesserung der Ergebnisse. Für die Aminosäureanalytik werden sechs Aminosäuren genutzt: Asparaginsäure, Glutaminsäure, Alanin, Phenylalanin, Leucin, Lysin. Sie erfahren keine Zerstörung oder Veränderung durch die Hydrolyse. Asparagin und Glutamin desaminieren aber zu Asparaginsäure und Glutaminsäure. Bei der Berechnung der Proteinkonzentration, aus der Aminosäureanalytik, muss dies Berücksichtigung finden. Mittels Anwendung eines internen Standards werden die gewonnenen Ergebnisse um Verluste bei der Probenaufbereitung sowie der Derivatisierung bereinigt. Zwei nichtproteinogene Aminosäuren werden zu diesem Zweck ausgetestet. Da eine chromatografische Trennung von Norleucin und Leucin nicht möglich ist, wird α-Aminobuttersäure verwendet. Die Neutralisation der Hydrolyseproben erfolgt mit Natronlauge, bevor sie mit Hilfe eines programmierbaren Autosamplers derivatisiert werden. Durch die genutzte Derivatisierung mit ortho-Phthaldialdehyd (OPA) entstehen Isoindole, die hydrophob und fluoreszenzdetektierbar sind. Das OPA-Reagenz verliert ungekühlt an Reaktivität. Dies muss bedacht werden, da frisches Reagenz größere Peakflächen generiert. Die chromatografische Trennung erfolgt mit einer Reversed Phase Säule. Eine Gradientenelution erfolgt mit einem 50 mmol/L Natriumacetatpuffer sowie einem hydrophoben Lösemittelgemisch. Verwendet wird Methanol, Acetonitril und Reinstwasser in Anteilen von 45/45/10. Methanol ist als reines Lösemittel ungeeignet. Aufgrund der hohen Viskosität des Methanol-Puffer-Gemisches steigt der Säulendruck auf bis zu 350 bar. Zudem führt die Entspannung des Gemisches im Detektor zur Ausgasung und damit zu Luftpeaks im Chromatogramm. Reines Acetonitril bringt schmalere Peaks und ein sauberes Chromatogramm hervor, ist aber dreimal teurer als Methanol. Die ermittelten Proteinkonzentrationen zeigen, dass die Genauigkeit der entwickelten Methode durchaus mit der des Bradford-Assays vergleichbar ist. Eine vollständige Validierung der Proteinquantifizierung mittels Aminosäureanalytik steht jedoch noch aus.