Expression des antimikrobiellen Peptides NK-2 in der Variante C7A-M11L-D21K in Pichia pastoris

Abstract

Die Zahl der antibiotikaresistenten pathogenen Mikroorganismen hat in den vergangenen Jahren immer weiter zugenommen. Daher liegt der Fokus der aktuellen Forschung unter anderem auf der Suche nach Alternativen zu den klassischen Antibiotika. Eine dieser Alternativen ist die Stoffklasse der antimikrobiellen Peptide. Ein besonders aussichtsreicher Kandidat innerhalb der Gruppe der antimikrobiellen Peptide ist NK-2. Da die chemische Synthese mit ca. 1000 €/mg sehr teuer ist, soll der Versuch unternommen werden, dieses Peptid in der rekombinanten Hefe Pichia pastoris herzustellen. Hierzu wurde in einer vorhergehenden Bachelorarbeit das Gen für NK-2 in das Genom von P. pastoris eingebaut.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde dieser Stamm in einem hochinstrumentierten Bioreaktor Biostat® ED5 der Firma Sartorius kultiviert und mittels Methanolinduktion zur Produktion des Zielpeptides angeregt. Während der Fermentation wurden in regelmäßigen Abständen Proben entnommen und mittels Agarosediffusionstest hinsichtlich antimikrobieller Aktivität analysiert.

The number of antibiotic-resistant pathogenic microorganisms has steadily increased in recent years. That is why current research is focusing on finding alternatives to classical antibiotics. One of these alternatives is the class of antimicrobial peptides. A promising candidate within the class of antimicrobial peptides is NK-2. The chemical synthesis being very expensive (ca. 1000 €/mg), an attempt of recombinant production of that peptide in the yeast Pichia pastoris is to be made. To this end, the gene for NK-2 was integrated in the genome of P. pastoris in the course of a prior Bachelor thesis. For the present work, this strain was cultivated in a highly instrumented bioreactor Biostat® ED5 from Sartorius and stimulated to produce the targeted peptide by methanol induction. During the fermentation, samples were taken at regular intervals and analysed in terms of antimicrobial activity by use of Agar Diffusion Assay.