Neue Antigene für die Dengue-Virus Diagnostik durch separate Expression der E-Protein Domänen 1 und 2

Abstract

Die Gruppe der Dengue-Viren (DENV) ist in vier Serotypen (DENV-1 bis DENV-4) unterteilt. Die meisten Epitope für Dengue-Antikörper bietet das virale Oberflächenprotein E, das aus den drei Proteindomänen ED1, ED2 und ED3 besteht. ED3 wird durch einen kontinuierlichen Genabschnitt bestimmt und kann daher einfach kloniert und als rekombinantes Protein exprimiert werden. Im Gegensatz dazu wird ED1 durch drei und ED2 durch zwei Sequenzabschnitte bestimmt, die nicht kontinuierlich vorliegen. Daher stehen rekombinante ED1- und ED2-Proteine nicht als separate Proteine zur Verfügung. Das Hauptziel dieser Arbeit war die separate Expression der ED1-und eD2-Domänen, um diese in einem serologischen Test einzusetzen. Da im Rahmen von Vorarbeiten die Herstellung reaktiver Antigene für die Serotypen DENV-2 und DENV-4 gelungen war, lag der Fokus dieser Arbeit auf Antigen-Konstrukten für DENV-1 und DENV-3. Zu diesem Zweck wurden verschiedene ED1- und ED2-Konstrukte hergestellt, indem die Sequenzabschnitte der Domänen mit drei Aminosäuren (Gly-Pro-Gly) verknüpft wurden, die ein turn motif bilden. Mit Hilfe von verschiedenen PCR-Methoden wurden zusammengesetzte Sequenzen für ED1 und ED2 erstellt und in das Plasmid pMAL-p4X einkloniert. Die Expression der rekombinanten Proteine erfolgte in E. coli. Die Antigene wurden als MBP-Fusionsprotein exprimiert, wodurch eine Aufreinigung mittels MBPAffinitätschromatografie durchgeführt werden konnte. Die Reaktivität der Antigene wurde mit Patientenseren aus Kolumbien ermittelt. Die Herstellung rekombinanter ED1- und ED2-Antigene der Serotypen DENV-1 und DENV-3 wurde erfolgreich realisiert. Es wurde festgestellt, dass die ED1-Antigene in größeren Mengen als die ED2-Antigene exprimiert werden können. Die Nutzung des Stamms E. coli BL21(DE3) war dabei von Vorteil. Es konnte pro Domäne und Serotyp je ein geeignetes Konstrukt ermittelt werden, welches in großen Mengen hergestellt werden kann und mit Patientenseren intensiv reagiert. Diese Konstrukte können nun als diagnostische Antigene in verschiedenen immunologischen Tests eingesetzt werden.

Dengue virus (DENV) is subdivided into four serotypes (DENV-1 to DENV-4). Viral surface protein E contains of three structural domains and is the major target for antibodies. It is formed by three domains, ED1, ED2 and ED3. ED3 can easily be cloned and expressed as a recombinant protein since it is coded by a single gene segment. In contrast, ED1 and ED2 sequences are organized differentially. The ED1 coding sequence is divided into three segments, and two gene segments encoding for ED2. Thus, recombinant forms of ED1 and ED2 are not available as separate proteins. Major goal of this thesis was to accomplish a separate expression of ED1 and ED2 to test these antigens with an immunological assay. In previous trials the productions of reactive antigens for DENV-2 and DENV-4 was accomplished, so that this thesis focused on DENV-1 und DENV-3. Therefore, different expression constructs for ED1 and ED2 were created by linking the gene segments with three amino acids (Gly-Pro-Gly) forming a turn motif. Using several PCR methods constructs for ED1 and ED2 were created and cloned into the pMAL-p4X plasmid. E. coli was used to express the recombinant protein as MBP-fusionprotein, allowing easy protein purification using affinity chromatography. Patients sera from Columbia were used to examine the reactivity of these antigens. The production of recombinant ED1 and ED2 antigens could be realised successfully for DENV-1 and DENV-3, although ED1 antigens were expressed in higher rates than ED2 antigens. Expression in E. coli BL21(DE3) was advantageous. For each domain and serotype a construct was determined, which could be expressed in high rates and leads to intensive reactions with patients sera. These constructs can be used as diagnostic antigens in several immunological assays.