Expressionsanalyse neuer Promotoren von Pichia pastoris für die Produktion rekombinanter Multiproteinkomplexe

Abstract

Pichia pastoris wird seit mehreren Dekaden sowohl in der Industrie als auch in der Forschung für die Produktion rekombinanter Proteine verwendet. Die Zahl der produzierten Proteine nimmt dabei kontinuierlich zu, wobei gleichzeitig immer neue Ansätze verfolgt werden, das Expressionssystem hinsichtlich seiner Expressionsleistung zu verbessern. Das Ziel dieser wissenschaftlichen Arbeit war die Untersuchung der Expressionsstärke von drei kürzlich entdeckten nativen Promotoren von P. pastoris. Dabei handelt es sich um die Promotoren eines GlycosylphosphatidylinositolAnkerproteines (PGCW14-Wildtyp und PGCW14M+20) und der Sorbitoldehydrogenase (PSDH), bei denen es sich nach aktueller Literatur um starke konstitutive Promotoren handelt. Der klassische konstitutive Promoter der Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (PGAP) und der induzierbare Promoter der Alkoholoxidase 1 (PAOX1) wurden dabei für den Vergleich ebenfalls untersucht. Als Markerprotein wurde das rotfluoreszierende RudolphRFP verwendet, sodass die Fluoreszenz als indirektes Maß für die Expression herangezogen werden konnte. Im Zuge der Arbeit wurden stabile P. pastoris X-33 Zelllinien generiert, selektiert und Einzelklone isoliert. Diese wurde daraufhin durch verschiedene Polymerase-Kettenreaktions-Ansätze hinsichtlich der erfolgreichen Integration der Expressionskassette in das Genom untersucht. Um die Vergleichbarkeit zwischen den Promotoren zu gewährleisten, wurden die isolierten Klone ebenfalls auf mögliche TandemRepeat-Insertionen überprüft. Nachgewiesene Einzelinsertions-Klone wurden daraufhin in einer Testexpression in 96Deepwell-Platten kultiviert und die Zellextrakte auf das Zielprotein untersucht. In den folgenden Versuchen wurden ausgewählte exprimierende Klone in Schüttelkolben kultiviert und die Fluoreszenz der Zellen mit einem Durchflusszytometer vermessen. Zeitgleich wurden in einem Hochdurchsatzkultivierung im Biolector-Mikroreaktor-System mehrere Klone je Promoter kultiviert und die Zelldichte und Fluoreszenz in einer Online-Messung gemessenen. Aus den gemessen Werten konnte als Vergleichskriterium die relative Fluoreszenz normiert auf die Biomasse berechnet werden. Es konnte gezeigt werden, dass beide verwendeten Varianten des GCW14-Promoters deutliche höhere Expressionsausbeuten erzielen als der klassische GAP-Promoter. In einem zusätzlichen Versuch wurde als Beispiel eines schwierig zu exprimierenden Proteins die extrazelluläre Domäne einer Mutante der Transmembran-Serinprotease Tmprss2 (D343N) mit PGCW14-M+20 exprimiert. Die Untersuchungen haben ergeben, dass der Promoter ein zum AOX1-Promoter vergleichbares Expressionslevel erzielt. Somit kann das Arsenal der für die Expression in P. pastoris verfügbarer Promotoren durch einen neuen starken konstitutiven Promoter ergänzt werden.

Pichia pastoris has been used for decades as an expression system to produce recombinant proteins in research and industry. So the number of produced recombinant proteins has increased continuously and new approaches have been followed to increase the performance of these systems. The aim of this project was the examination and comparison of three native promoters of P. pastoris, which have been recently discovered: This includes the Promoter of a glycosylphosphatidylinositol-anchor-protein (PGCW14-Wildtyp, PGCW14M+20) and of the sorbitol dehydrogenase (PSDH), which are described to be equal or stronger than the classic constitutive Promoter of the glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (PGAP). Additionally the strong alkoholoxidase 1 Promoter (PAOX1) were also examined. The redfluorescent protein RudolphRFP was used as markerprotein and the red fluorescence, which is applicable as a comparison criterion for the promoter performance, was measured. To do so, stabile cell lines of P. pastoris X-33 cells were generated, selected and isolated. The isolated clones have been tested for a successfully integrated gene-cassette and possible multi-copy insertions using different polymerase chain reaction approaches. To guarantee the comparability, only single-insertion clones have been examined comparatively. Qualified clones have been cultivated in different systems. To test the expression of the targetprotein 96-deepwellplates have been used for the cultivation of multiple clones and the protein has been detected using western blots. Furthermore, single chosen clones have been grown in shaking flasks. For the measurement of the fluorescence a flow cytometer was used. At the same time the high-througput biolector system has been used to cultivate and measure the cell density and red fluorescence of multiple clones in an online-measurement. With the measured data the relative fluorescence has been calculated, which gives evidence for the expression performance of the different clones. In a last experiment the PGCW14M+20-Promoter, which gave the best results in the previous experiments, was used to express the difficult to express protein Tmprss2, which has already been expressed using the AOX1-Promoter. The examination showed that the PGCW14M+20 almost reached the performance of the inducible PAox1, which is supposed to be one of the strongest promoters in P. pastoris. This makes it a promising candidate for the constitutive expression of recombinant proteins in the P. pastoris expression system.