Optimierung eines Infektionsmodells für Dengue-M/E pseudotypisierte HIV-1-Partikel

Abstract

Im ersten Teil dieser Arbeit wurden Dengue-M/E pseudotypisierte HIV-1-Partikel mit den Hüllproteinen aller DENV Serotypen hergestellt. Dies erfolgte mit Hilfe von jeweils zwei Plasmiden. Ein Plasmid codiert für das Virusgenom (pNLlucAM), das andere Plasmid codiert für die M/E-Hüllproteine des entsprechenden DENV. Um die Menge der infektiösen Titer von M/E-Pseudotypen zu steigern, wurde die Luciferase-Aktivität der co-transfizierten HEK293T-Zellen gemessen. Zusätzlich wurden die partikelhaltigen Zellkultur-überstände auf Infektiosität der Pseudotypen getestet. Ergebnis war ein umgekehrter Zusammenhang. Bei Steigerung der Menge an Plasmid-DNA bei der Transfektion ging die Luciferase-Aktivität in den transfizierten HEK291T-Zellen zurück, während die Infektiosität der Partikel anstieg. Der Schwellenwert für die DNA-Menge war bei 45 μg Plasmid-DNA im molaren Verhältnis 1:14 von Virusvektor zu M/E-Expressionsvektor. Die 45 μg Plasmid-DNA bezog sich auf 5·106 Zellen in einem 6-well, was einer Fläche von etwa 9 cm2 entsprach. Bei einer transfizieren Plasmid-Menge über 45 μg wurden abnehmende Pseudotypen-Titer gemessen. Bei geringeren Plasmid-Mengen sank die Infektiosität um den Faktor 100. Demnach wurde die transfizierte DNA-Menge gegenüber dem Incella Transfektionsprotokoll und vorherigen Arbeiten um das 17,5-fache gesteigert. In den Kontrollexperimenten mit HIV-1 pseudotypisierten HIV-1-Partikeln hingegen wurden die höchsten Infektiositäten der partikelhaltigen Überstände bei geringen Plasmid-Mengen gemessen, wodurch sich die Resultate konkret auf Dengue-M/E pseudotypisierten HIV-1 Partikel beziehen. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Einfluss der Partikelfiltration, des FCS und der Zelldichte auf die Infektion untersucht, um das Infektionsmodell zu verbessern. Die größte Bedeutung für die Infektionen zeigten die Zelldichten der DENV permissiven VeroB4-Zelllinie. Bei zu hohen Zelldichten trat eine Zellkontakthemmung auf, welche die Infektion einschränkte und selektiv auch inhibierte. Ergebnis war eine optimale Zelldichte von etwa 70% zum Zeitpunkt der Infektion, um gleichmäßig Infektionsraten zu erzielen. Im dritten Teil der Arbeit wurden die Transfektions-Ausbeuten durch TCID50-Bestimmungen quantifiziert. Die infektiöse Dosis DENV-2 pseudotypisierter HIV-1-Partikel entsprach einer Verdünnung von 1:100. Demnach können mit einer Transfektion in 6-well-Platten etwa 3000 Infektionsexperimente (im 96-well-Format) durchgeführt werden. Die Ergebnisse zeigten eine Steigerung der Infektiosität der partikelhaltigen Zellkulturüberstände um das 150-fache im Gegensatz zu vorherigen Arbeiten. Daher konnten durch die gesteigerten transfizierten Plasmid-Mengen deutlich mehr Dengue-M/E pseudotypisierte HIV-1-Partikel gebildet werden.

In the first part of this study dengue-M/E pseudotyped HIV-1 particles with the envelope proteins of all four DENV serotypes were produced. The particles were made using two plasmids. One plasmid encodes the viral HIV-1 (env- Luc+) genome (pNLlucAM) while the other plasmid encodes for example the DENV-1-M/E envelope proteins, respectively. To increase the amount of the infectious titers of M/E pseudotypes the luciferase activity of the co-transfected HEK293T cells were measured. Additionally, the infectiosity of the cell culture supernatant containing the particles was tested by VeroB4 infection. The outcome was a reversed correlation. With the increase of transfected plasmid DNA the luciferase activity in the transfected HEK293T cells decreased, whereas the infectiosity of the pseudotyped particles increased. The threshold of the DNA amount was 45 μg plasmid DNA with a molar ratio of 1:14 of viral vector to M/E expression vector. The 45 μg plasmid DNA referred to 5·106 cells in the 6-well-cell culture plate which is equivalent to a surface of approximately 9 cm2. At a transfected amount of plasmid above 45 μg decreasing infectiosities were detected. At a lower amount of plasmid the infectiosity decreased by a factor of 100. Thus, the transfected amount of DNA was 17,5-fold higher compared to the Incella transfection protocol and previous studies. During the control experiments with HIV-1 pseudotyped HIV-1 particles however the slightest amounts of plasmid DNA resulted in the highest infeciosities of the cell culture supernatant containing the particles. Therefore these results are highly specific for the generation of dengue-M/E pseudotyped HIV-particles. In the second part of this study the impact of particle filtration, FCS concentration and the cell density on VeroB4 infections were determined to improve the pseudotype infection model. The disseminated cells showed the major significance. At excessive cell densities a cell contact inhibition occurred which restricted and selectively inhibited the infections. The result was an ideal cell density of approximately 70% at the time of the infection to detect consistent infection rates. In the third part of this study the yields of the transfections were quantified by a TCID50 assay. The infectious dose of DENV-2 pseudotyped HIV-1 particles equated to a dilution of 1:100. Thus, about 3000 infection experiments (in 96-well) can be performed with supernatants transfected in 6-well-cell cultures. The results showed a general 150-fold increase of the infectiosity of the cell culture supernatant containing the particles compared to previous studies. Therefore significantly more dengue-M/E pseudotyped HIV-1 particles were generated by the optimized protocol for pseudotype generation, presented in this study.