Etablierung einer dreistufigen Kultivierung der Hefe Pichia pastoris in einem Laborfermenter

Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit sollte eine reproduzierbare dreistufige Kultivierung in einem La-borfermenter etabliert werden. Als Mikroorganismus wurde ein GFP produzierender Pichia pastoris-Stamm eingesetzt. Zur Herstellung der rekombinanten Proteine durch P. pastoris kommt typischerweise ein dreistufiger Prozess zum Einsatz. Dieser besteht aus einer wachstumsunlimitierten Batch-Phase und einer wachstumslimitierten Fed Batch-Phase auf Glycerin sowie einer Produktionsphase auf Methanol. Die Durchführung aller Fermenta-tionsprozesse wurde mit dem Datenaufzeichnungs- und Überwachungssystem MFCS/win gesteuert. Durch die Verbindung mit einem anderen Programmmodul, MFCS-Tool, konnte das Prozessführungssystem MFCS/win einige Vorgänge wie die Erkennung des Batch-Endes, die Durchführung der Fed Batch- und der Produktionsphase steuern. Um die Produktion der Proteine in dieser Arbeit zu beobachten, wurde GFP als Zielprodukt betrachtet. Die Gene dieses Proteins waren in einem P. pastoris KM71H-Stamm transfor-miert und für die Durchführung einer dreistufigen Kultivierung bereitgestellt. Da die erfor-derlichen Daten über diese Zellen fehlten, wurde vor den dreistufigen Fermentationen Schüttelkolbenversuche durchgeführt. Hierdurch konnten eine maximale Wachstumsrate von 25 h-1, ein benötigtes Kryovolumen von 1500 μl pro 100 ml Vorkultur im 1000 ml-Schikanekolben für das Erreichen einer gewünschten Ziel-OD von 3 – 5 AU vor Animpfen des Fermenters und eine Dauer der Vorkulturinkubation von 20 h ermittelt werden. Die verwendeten Pichia-Zellen waren nicht in der Lage das Zielprotein in einer Menge zu produzieren, die ohne Fluoreszenzmessungsmethoden nachgewiesen werden konnte. Das Einfügen des transformierten GFP-Gens in eine nicht geeignete Stelle der AOX-Sequenz in den verwendeten Pichia-Zellen könnte eine Ursache für die niedrige GFP-Produktion sein. Insgesamt wurden drei dreistufige Kultivierungen mit den vorhandenen rekombinanten P. pastoris-Zellen im BIOSTAT® Aplus durchgeführt, um die Reproduzierbarkeit der durchge-führten Kultivierngen zu überprüfen. Die ermittelten Daten während der Batch-Phase stellen eine reproduzierbare Batch-Phase dar. Bei der Fed Batch- und der Produktionsphase verliefen die Variablenprozesse nicht wie erwartet. Aufgrund des Einsatzes einer zu starken Pumpe in den ersten zwei Fermentationen, wurde die Substratkonzentration dessen Fed Batch-Medium verringert, damit die Zielsubstratkon-zentration pro Zeit in den Bioreaktor zugeführt wird. Bei der zweiten Fed Batch-Phase tauchte ein weiteres Problem auf, und zwar die Bildung sehr starker Schäume, die nicht durch eine automatische Antischaummittelzugabe vernichtet wurden. Diese löste einige Prozessstörun-gen auf, sodass sich anhand der ermittelten Daten während der zweiten Fed Batch-Phase keine besondere Aussage treffen lässt. Trotz der Verwendung einer anderen Pumpe bei der dritten Fermentation wurde das Pumpprofil am Anfang der dritten Fed Batch-Phase nicht exponentiell, sondern konstant betrieben. Eine eventuelle Software-Störung bei dem Pro-grammmodul MFCS-Tool könnte dies verursacht haben. Durch zwei manuelle Methanol-Zugaben wurden die Zellen in der ersten Produktionsphase zugefüttert beziehungsweise induziert. Diesem gegenüber war eine schnelle Methanol-Aufnahme von den Zellen auffällig. Es wurde versucht, die letzten zwei Produktionsphasen mit einem exponentiellen Pumpprofil zu betreiben. Dies konnte aber wegen einer eventuel-len Störung beim MFCS-Tool nicht gelingen, so dass die Zellen mit einem konstanten Pumpprofil zugefüttert wurden. Die Adaption der Zellen an das Methanol wurde bei der dritten Produktionsphase zu ver-schiedenen Zeitpunkten durch das Ausschalten der Pumpe bis zum Auftauchen eines pO2-Spikes überprüft. Die ermittelte Dauer zwischen dem Pumpenausschalten und dem Auftau-chen eines pO2-Spikes betrug 1,26 min. Nur bei einer in der Zielsetzung genannten Phase zur Reproduktion einer dreistufigen Kulti-vierung in einem Laborfermenter wurde das erwartete Ziel erreicht, und zwar bei der Batch Phase. Aufgrund der Probleme bei den verwendeten Pumpen tragen die Zielvorstellungen auch bei der Bestimmung des Substratverbrauchtes für den ganzen Prozess nicht bei.