Etablierung einer Kultivierung von Pichia pastoris in Laborfermenter zur Expression von eGFP

Abstract

Im Zuge dieser Bachelorarbeit sollte eine Kultivierungsstrategie zur Expression von eGFP, für einen zuvor klonierten Stamm der Hefe Pichia pastoris, aufgestellt werden. Zielführend wurde der, für die Produktion von remobinanten Proteinen, typische dreistufige Prozess der Hochzelldichtekultivierung aufgestellt. Dieser wurde mit drei Klonen (1, 3, 5) der Hefe durchgeführt und auf deren Expressionsverhalten hin analysiert. Das Protein eGFP spielt eine wichtige Rolle als biologischer Marker in der Forschung. Die Fusionierung mit einem anderen Protein, ohne Benachteiligung beider Proteine, hat eGFP zu einem essentiellen Werkzeug der Zellbildgebung werden lassen. [10] Für die Arbeit standen zwei Bioreaktoren des Modells BIOSTATR Aplus zur Verfügung, mit denen der Prozess zum Großteil automatisiert werden konnte. Der dreistufige Kultivierungsprozess wurde in das Softwareleitsystem MFCS/win eingearbeitet und stets optimiert. Der Fermentationsprozess besteht aus einer Zellanzucht durch eine wachstumsunlimitierte Batchphase und einer wachstumslimitierenden Fed-Batchphase. In beiden Phasen wird mit Glycerin als Susbtrat gearbeitet. In der Batchphase wurden stets 30 g/L und für die Fütterung ein Reservoir mit 400 g/L verwendet. Ebefalls wurden alle Kultivierungen mit einer 15 stündigen Fed-Batchphase betrieben. Es folgt eine Produktionsphase mit Methanol als Substrat und Induktor für die Expression. Der verwendete rekombinante Stamm von Pichia pastoris wurde zuvor in der AG Noll an der HAW kloniert. Daher gab es noch keine Kenntnisse über Wachstumscharakteristika des Stammes und Vorversuche im Schüttelkolben wurden durchgeführt. Die Fermentationen der Klone 1, 3 und 5 verliefen mehrheitlich ohne Komplikationen und führten jedes Mal zu einer messbaren und unter UV-Licht sichtbaren eGFP-Bildung. Alle Kultivierungen erreichten eine hohe Zelldichte von um die 76 g/L. Dennoch zeigte sich bei den Klonen, in den jeweiligen Produktionsphasen, bezüglich der Verarbeitung des Methanols kein eindeutiges Verhalten. Dazu kam es bei keinem der Klone zu einem Zellwachstum in dieser Phase. Klon 5 weist, aufgrund einer schwankenden Zellkonzentration, eine alternierende wachstumgekoppelte Produktbildungsrate auf. Klon 3 wiederum erreicht in der Produktbildungsrate knapp Werte, die über Null liegen und besitzt in der volumenspezifischen Fluoreszenz die schwächsten Werte. Etwas bessere Werte sind bei Klon 1 zu vernehmen. Dieser hat im Vergleich mit den anderen Klonen die höchste volumenspezifischen Fluoreszenz und auch eine gleichmäßige eGFP-Bildung. Alle Klone sind fähig überwiegend konstant eGFP zu bilden, dennoch ist die Produktion rekombinanter Proteine auf metabolischer Ebene ein kostspieliger Prozess. Es führt zu einer Abweichung vieler zellulärer Prozesse von ihrem evolutiven Ziel des Zellwachstums und -Erhaltung und kann zu einer energetischen Insuffizienz im Metabolismus führen. [6] Dies ist deutlich bei den Klonen zu sehen und der Grund, weshalb Klon 1 im Gesamten als ertragreichster Produzent abschneidet. Der AOX1 Promotor dieses Klons ist nicht durch andere Komponenten im Medium induzierbar, sodass es nur beim Vorhandensein von Methanol zur Bildung von eGFP unter einem Zellerhaltungsstoffwechsel kommt. Dies weist auch bei Klon 1 auf einen energetischen Konflikt in den Zellen hin, dennoch nicht so ausgeprägt wie beiden anderen. Das Ziel eine Kultivierungsstrategie für die Expression von eGFP aufzustellen, wurde mehrheitlich erreicht. Lediglich die Produktionsphase bedarf einer weiteren Bearbeitung in Bezug auf eine kontinuierliche Methanolzufuhr. Fernerhin kann, durch den Vergleich der Klone, eine Festlegung auf Klon 1 als günstigster Produzent für Folgeversuche erfolgen.