Herstellung des antimikrobiellen Peptides NK-2 ALK als Fusionsprotein in Escherichia coli BL21 (DE3)

Abstract

In dieser Arbeit konnte das Fusionsprotein ONC-DCless-H6-(P)-NK-2-ALK erfolgreich hergestellt werden. Für den Upstreamprozess wurde zuerst eine Batch-Kultivierung für E. coli BL21 (DE3) am 3-Liter Bioreaktor entwickelt. Dafür wurde ein S88-Rezept erstellt und erprobt. Fehler im S88-Rezept wurden behoben und kleinere Umbauten am Bioreaktor wurden für eine erleichterte Bedienung durchgeführt. Im Anschluss konnte eine Fed-Batch-Kultivierung etabliert werden. Dafür wurde die Methode der Batch-Kultivierung abgeändert und verfeinert. Dazu gehörte die Erweiterung des S88-Rezeptes und der Add-ons von MFCS. Die Fertigstellung der Fed-Batch-Methode beinhaltete außerdem die Aufnahme der Produktionsphase. Die Durchführung der Fed-Batch-Kultur führte zu einer Kulturbrühe, die für den Aufreinigungsprozess genutzt werden konnte. Der Downstreamprozess beinhaltete den Zellaufschluss mit Ultraschall, das Solubilisieren von Inclusion Bodies, das Durchführen einer Metallaffinitätschromatographie sowie die Säurespaltung des Fusionsproteins. Die einzelnen Schritte konnten mit Hilfe von SDS-Gelen auf ihren Erfolg hin überprüft werden. Die Annahme, dass sich das Fusionsprotein in Inclusion Bodies befindet, konnte auf diese Weise bestätigt werden. Das Abtrennen von Zelldebris gestaltete sich als schwierig und wurde durch die Herabsenkung der Zellkonzentration beim Ultraschallaufschluss bewältigt. Nach dem Tausch einer wahrscheinlich „ausgebluteten“ Chromatographiesäule konnte das Fusionsprotein mit der IMAC von anderen Proteinen getrennt werden. Aufgrund mehrerer verbleibender Banden im SDS-Gel wurde eine Oligomerisierung des AMPs vermutet. Die anschließende Säurespaltung konnte durchgeführt werden, wobei Verbesserungspotenzial offengelegt wurde. Die Neutralisierung mit Ammoniak führte zu der gewünschten Präzipitation der proteindesignten Onkonase und diese konnte von dem AMP getrennt werden. Eine Auswertung der Massen der Proteinbanden mit dem Programm Image-Lab wurde durchgeführt, jedoch wurden die Ergebnisse eher als grobe Richtung gedeutet. Der Produktionsprozess hat gezeigt, dass mit der Bildung dieses Fusionsproteins AMP in E. coli hergestellt und aufgereinigt werden kann.