| Abstract: | Der von-Willebrand-Faktor (VWF) ist als multimeres Glykoprotein ein wesentlicher Bestandteil der primären Hämostase. Der VWF wird unter bei Gefäßschäden auftretendem erhöhtem Scherstress einer Konformationsänderung unterzogen und rekrutiert daraufhin Blutplättchen, um die Wunde zu schließen. Dieser Prozess wird durch die Protease ADAMTS13 reguliert, die den VWF nur dann schneidet, wenn die Schnitt... Der von-Willebrand-Faktor (VWF) ist als multimeres Glykoprotein ein wesentlicher Bestandteil der primären Hämostase. Der VWF wird unter bei Gefäßschäden auftretendem erhöhtem Scherstress einer Konformationsänderung unterzogen und rekrutiert daraufhin Blutplättchen, um die Wunde zu schließen. Dieser Prozess wird durch die Protease ADAMTS13 reguliert, die den VWF nur dann schneidet, wenn die Schnittstelle in der A2 Domäne des VWF durch kraftbedingte Streckung freigelegt wird. Punktmutationen in ADAMTS13 können die Sekretion oder Funktion von ADAMTS13 soweit einschränken, dass sich Thromben aus ultralangen VWF-Multimeren und Thrombozyten bilden. Hieraus resultiert eine lebensbedrohliche Krankheit, die als thrombotisch-thrombozytopenische Purpura (TTP) oder Upshaw-Schulman Syndrom (USS) bekannt ist.
In dieser Arbeit wurde die Aktivität von mehreren ADAMTS13-Varianten, die in Patienten mit USS gefunden wurden, in einem Scherfluss-Assay gemessen und verglichen. Dieser Assay basiert auf der kinetischen Analyse der Proteolyse von VWF-Fäden auf der Oberfläche von Endothelzellen. Zusätzlich wurden präliminäre Versuche durchgeführt, um zu untersuchen, ob die Proteolyse von VWF-Plättchen-Aggregaten durch ADAMTS13 auch aggregometisch bestimmt werden kann. Die Ergebnisse sollten Rückschlüsse auf Struktur-Funktions-Beziehungen und Einblicke in die USS-verursachenden Mechanismen liefern.
Da die untersuchten ADAMTS13-Varianten im Patienten sehr geringe Plasmakonzentrationen aufweisen wurde außerdem ihre intrazelluläre Lokalisation in HEK293-Zellen mittels Immunfluoreszenz bestimmt, um Hinweise auf Prozessierungsfehler während der Biosynthese zu erhalten. Hierbei zeigten sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den Varianten und keine signifikante ER-Retention. Diese Daten sprechen dafür, dass Unterschiede in der Sekretion von ADAMTS13 nicht durch Prozesse im ER verursacht werden. Die Aufklärung der Sekretionsdefekte wird Gegenstand weiterer Untersuchungen sein.
Mittels des zellbasierten Flussassays konnte erfolgreich und gut reproduzierbar gezeigt werden, dass alle hier untersuchten ADAMTS13-Varianten unterschiedlich stark ausgeprägte Restaktivitäten aufweisen. Dieser Befund deutet daraufhin, dass der Hauptmechanismus, durch den diese Varianten USS verursachen, eine Reduktion der Sekretion ist. Der aggregometrische Assay zeigte die Unterscheidbarkeit von ADAMTS13-Varianten zum Wildtyp mit einem technisch einfachen und nicht zeitaufwändigen Assay. Eine Etablierung eines solchen Assays könnte in der klinischen Diagnostik Verwendung finden.
The von Willebrand Factor (VWF) is a multimeric glycoprotein and an essential component of primary hemostasis. The VWF undergoes a conformational change under elevated shear forces that occurs upon vessel damage. VWF recruits platelets to close a wound. This process is controlled by the protease ADAMTS13, which cuts VWF solely when the VWF A2-domain is unraveled by force-induced stretching. Missen... The von Willebrand Factor (VWF) is a multimeric glycoprotein and an essential component of primary hemostasis. The VWF undergoes a conformational change under elevated shear forces that occurs upon vessel damage. VWF recruits platelets to close a wound. This process is controlled by the protease ADAMTS13, which cuts VWF solely when the VWF A2-domain is unraveled by force-induced stretching. Missense-mutations in the corresponding gene of ADAMTS13 can limit the secretion or function of ADAMTS13 to such an extent that platelets form thrombi with ultra-large VWF multimers, resulting in a life-threatening disease. It is known as the congenital form of thrombotic thrombocytopenic purpura (TTP), called the Upshaw-Schulman Syndrome (USS).
In this thesis, the activity of several ADAMTS13 variants from patients with USS was measured and compared in shear-flow assays. The shear-flow assay is based on the observation of a kinetic analysis of the proteolysis of VWF-strings on the surface of endothelial cells. Furthermore, preliminary tests of the proteolysis of VWF-platelets-aggregates using aggregometry were conducted. Conclusions can be drawn on structure-function relationships and on the mechanisms responsible for USS.
Because the observed ADAMTS13-variants show significant decreased residual concentrations in the plasma of patients, the intracellular localization was observed in HEK293-cells using immunofluorescence. Using this method, it was possible to get a hint on processing errors during biosynthesis. No significant differences between the variants and no ER-retention was observed. These results suggest that differences in the secretion of ADAMTS13 are not caused by processes in the ER. The explanation of ADAMTS13 secretion deficiency is subject of further research.
Results of the cell-based shear flow assays showed reproduceable strong but varying residual activity of all observed ADAMTS13-variants. This suggests the main USS-causing mechanism of these variants is a secretion deficiency.
The aggregometry-assay showed that it is possible to distinguish ADAMTS13-variants from the wild type protein with a technically simple and less time-consuming procedure. Establishment of such an assay could be used in clinical diagnostics. |
