Darstellung und Untersuchung von ZIKV-prM/E pseudotypisierten HIV-1-Partikeln

Abstract

Für Flavivirus pseudotypisierte HIV-1-Partikel gab es bisher nur Arbeiten zu den vier Dengueviren-1-4. In dieser Arbeit wurden vier weitere Flavivirus-Pseudotypen hergestellt, welche die Hüllproteine der Flaviviren Usutu, West-Nil, Japanische-Enzephalitis und Gelbfieber tragen. Um dies zu erreichen wurde aus Überständen infizierter Zellen virale RNA isoliert und in cDNA umgeschrieben. Durch die Polymerase-Ketten-Reaktion wurde der Genabschnitt für die beiden Gene prM und E amplifiziert. Nach Klonierung in einen Zwischenvektor (pCR™2.1) wurde die Sequenz kontrolliert und die entsprechenden Genfragmente wurden in den Expressionsvektor pHA überführt. So wurden vier Plasmide pHA-USU-BH65, pHA-WN-NY, pHA-YF-17D und pHA-JE-NAK hergestellt. Ein neu auftretendes Virus ist das Zikavirus. Es zirkuliert in vielen Varianten. Prinzipiell existieren zwei Arten, die asiatische und die afrikanische. Von beiden Arten wurden Pseudotypen hergestellt. Dafür wurde cDNA, von einem europäischen Programm (EVAg) und vom Institut Pasteur zur Verfügung gestellt. Davon ausgehend, wurden die vier Plasmide pHA-Z41519, pHA-ArD, pHA-Z41524 und pHA-ZIKA-H/PF hergestellt. Diese Pseudotypen entsprechen den Zikaviren Dakar41519, ArD158084, Dakar41524 und H/PF/2013. Als Vektor für die HIV-1-Partikel wurde der virale Vektor pNL Luc AM verwendet, da er sich in früheren Arbeiten als der am besten geeignetste Vektor für die Herstellung der Dengue-Pseudotypen erwiesen hatte. Nach Transfektion von HEK293T-Zellen mit Kombinationen von prM/E-Expressionsvektor und pNL Luc AM wurden die Überstände der transfizierten Zellen an Tag 3 gesammelt und für Infektionsversuche verwendet. Aus den Infektionsversuchen ergab sich folgendes Bild. Bei den vier Pseudotypen Usutu, West-Nil, Gelbfieber und Japanische-Enzephalitis wurden die höchsten Infektionstiter für Usutu beobachtet. Bei den vier Zika-Pseudotypen war der Dakar41519-Pseudotyp am effizientesten. Anhand dieser Daten wurden von beiden Viren, Dakar41519 und Usutu-BH65, chimäre Pseudotypen durch den gegenseitigen Austausch der Domäne 3 des E-Proteins hergestellt. Damit entstanden zwei weitere Plasmide pHA-U12Z3 und pHA-Z12U3. Auch hier wurden Pseudotyp-Partikel isoliert und in Infektionsexperimenten eine reproduzierbare, hohe Effizienz für die Infektion von VeroB4-Zellen gezeigt. Insgesamt wurden zehn Flavivirus-Pseudotypen hergestellt und getestet. In der Reihenfolge West-Nil, Gelbfieber und Japanische-Enzephalitis nahmen die Infektionstiter stark ab. Die höchsten Infektionstiter wurden für die Usutu- und Zika-Pseudotypen erhalten, gefolgt von den Usutu und Zika Chimären-Pseudotypvarianten U12Z3 und Z12U3.