Klonierung und rekombinante Expression von eGFP in Pichia pastoris

Abstract

Pichia pastoris ist ein seit Jahrzehnten verwendeter Expressionsorganimus für die Produktion von rekombinanten Proteinen und wird sowohl in der Forschung, als auch in der Industrie verwendet. Das Ziel dieser Arbeit war es, einen Pichia pastoris Expressionsstamm zu konstruieren, der das rekombinante Protein eGFP produziert. Gesteuert werden sollte die Genexpression über den induzierbaren AOX1 Promotor. Im Rahmen dieser Arbeit war es erforderlich, einen geeigneten Expressionsvektor zu klonieren. Dazu wurde das Golden Gate Klonierungsverfahren verwendet. Das Transformieren der Pichia Zellen erfolgte mittels Elektroporation. Die Integration der Genkassette an die gewünschte Position im Hefegenom wurde mittels PCR überprüft und durch Sequenzierung bestätigt. Molekularbiologisch überprüfte Klone wurden für eine small-scale Kultivierung verwendet. Die funktionale Kontrolle erfolgte dann über eine SDS-PAGE und eine fluoreszenzmikroskopische Untersuchung. Dabei konnte der Nachweis erbracht werden, dass eGFP intrazellulär nach der Induktion vorliegt.