Etablierung eines sensitiven Zelltoxizitäts-Assays zum Ausschließen zelltoxischer Effekte von Sedimentproben im Multiplexformat mit anschließendem Estrogenrezeptor-Reportergen Assay

Abstract

Der Fokus dieser Arbeit liegt auf der Messung estrogen- und ecdysonaktiver Schadstoffe von aus Sedimenten der Elbe gewonnenem Porenwasser. Sedimente können als Schadstoffdepot und als „Gedächtnis vergangener Gewässerverschmutzungen“ angesehen werden (Zuellig 1956), da Schadstoffe sich in Abhängigkeit ihres chemischen Verhaltens an Sedimente und Schwebstoffe anlagern. Die Durchführung erfolgt mithilfe zweier Zelllinien, die mit dem Estrogen-Rezeptor (VM7Luc4E2) und dem Ecdyson-Rezeptor (CHO-K1) transfiziert sind. Zur Detektion estrogener und ecdysoner Chemikalien in Umweltproben wird einer der empfindlichsten und in hohem Maße reagierenden Reportergen-Assays, die heutzutage verfügbar sind, verwendet und soll in der Arbeitsgruppe AAT der HAW etabliert werden; es handelt sich um den Estrogen-Rezeptor (ER)/Ecdyson-Rezeptor (EcR) vermittelten chemisch aktivierten Luciferase Genexpressions-Assay (J. Legler et al. 1999). Dieser deckt alle Ergebnisse, die an der Rezeptor-Transaktivierung beteiligt sind, von der Aufnahme der Verbindung durch die Zelle bis zur Synthese von Proteinen, ab (Houtman 2007). Vor der Etablierung des ER/EcR-Reportergen-Assays wird ein Zelltoxizitätstest etabliert, der für weitere Messungen unverzichtbar war. Es handelt sich um den „Lebendprotease“ -Test, der dazu dient, eventuelle zelltoxische Effekte der Porenwasserproben und weitere Einschränkungen der Zellvitalität, die den ER/EcRReportergen- Assay verfälschen würden, auszuschließen. Dieser Test wird aufgrund der nachfolgenden drei wichtigen Kriterien ausgewählt; Erstens wegen seiner hohen Sensitivität, zweitens der Möglichkeit der Durchführung im Multiplexformat, sowie der Tatsache, dass weder eine Zelllyse noch eine Luciferasemessung benötigt werden. Beide Vorgänge - eine Zelllyse sowie die Luciferasemessung - finden im ER/EcR-Assay Anwendung. Die Etablierung erfolgte zu Beginn mithilfe des CellTiter-Fluor™ Cell Viability Assays der Firma Promega, im Verlauf der Entwicklung werden die Reagenzien selbst erstellt. Mit unterschiedlichen Digitonin-Konzentrationen als Positivkontrolle konnte die mittlere Hemmkonzentration (EC50), eine 50%ige Inhibition der Zellaktivität, für eine Zelllinie (CHO-K1) bestimmt werden. Diese betrug 12,41 μg/ml. Die Etablierung dieses Assays zur Messung estrogener Aktivität konnte im Rahmen dieser Bachelorarbeit nicht erfolgreich abgeschlossen werden. Die Messung ecdysoner Aktivität wird in dieser Arbeit nur theoretisch behandelt. Es werden jedoch wesentliche Vorversuche durchgeführt, anhand derer wichtige Informationen für die Etablierung des Assays sowie Handlungsempfehlungen für eine Optimierung eingesetzter Methoden erarbeitet werden konnten. Die Problemanalyse umfasst folgende Kriterien: • Eine Gewährleistung der Zellvitalität der VM7Luc4E2 Zellen soll mindestens 80% beim Ausplattieren betragen. • Ein gleichmäßiges Ausplattieren der Zelllinie mit der Multistepper-Pipette soll durch Aufnahme eines kleineren Volumens an Zellsuspension erfolgen - somit kann auch eine regelmäßigere Resuspension gewährleistet werden. • Ein Trypsinieren der Zellen im „Assaymedium“ soll vermieden werden. Das „Assaymedium“ beinhaltet bereits eine geringere Konzentration an Glucose und Wachstumshormonen, was die Vitalität der empfindlichen VM7Luc4E2 Zellen bereits herabsetzt. Aufgrund des Einsatzes im ER-Reportergen-Assay, müssen die Zellen zwangsläufig ins Assaymedium überführt werden. Das Trypsinieren beeinträchtigt die Vitalität zusätzlich. Diese und weitere Kriterien, die in der Diskussion ausführlich behandelt werden, listen Möglichkeiten auf, die eine erfolgreiche Etablierung des ER-Reportergen-Assays gewährleisten könnten. Diese Arbeit stellt die Basis der Etablierung dieser komplexen Methode dar.