Klonierung und rekombinante Expression der KlenTaq DNA Polymerase in Pichia pastoris

Abstract

Das Ziel dieser Arbeit war es, mittels einem Pichia pastoris (P. pastoris) Expressionsstamm die KlenTaq DNA Polymerase rekombinant zu exprimieren. Die Transkription des Zielgens wurde unter Kontrolle des Alkohol-Oxidase 1 Promotors gestellt. Dies ist ein sehr starker P. pastoris Promotor, welcher durch Methanol in Abwesenheit von Glucose oder Glycerin induziert werden kann. Zunächst wurde der Expressionsvektor pBSY2H4_KlenTaq durch Golden Gate (GG) Klonierung konstruiert, in einen Escherichia coli (E. coli) Stamm transformiert und die Gensequenz durch Polymerase-Kettenreaktion (eng. polymerase chain reaction, PCR) und Sanger-Sequenzierung überprüft. Um P. pastoris mit diesem Expressionsvektor transformieren zu können, wurde dieser durch Restriktionsverdau linearisiert. Sowohl die Transformation von E. coli, als auch P. pastoris erfolgte mittels Elektroporation. Der gewünschte Einbau des Vektors in das P. pastoris Genom wurde mittels PCR und Sanger-Sequenzierung bestätigt. Durch small-scale Expression und SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) konnte bei den so überprüften Klonen nachgewiesen werden, dass die KlenTaq DNA Polymerase extrazellulär exprimiert wurde. Des Weiteren lassen die Charakterisierung der KlenTaq DNA Polymerase durch Teilsequenzierung der Gensequenz und die Aufreinigung über einen N-terminalen His-tag auf eine erfolgreiche Expression schließen. Durch Analyse der exprimierten KlenTaq DNA Polymerase auf DNA-Polymeraseaktivität konnte keine Funktionalität nachgewiesen werden. In weiteren Arbeiten sollte daran geforscht werden, die DNA-Polymeraseaktivität nachzuweisen.