Charakterisierung der Transformation primärer Nagerzellen durch Onkogene des HAdV-G52

Abstract

Das multifunktionale E1B-55K-Protein der frühen Transkriptionseinheit 1B des humanen Adenovirus Spezies C, Typ 5 (HAdV-C5) besitzt ein onkogenes Potential und spielt eine fundamentale Rolle innerhalb des gesamten viralen Replikationszyklus. In Zusammenarbeit mit dem viralen Protein E1A trägt es zur vollständigen Transformation von primären Säugerzellen bei. E1A initiiert durch Wechselwirkung mit mehreren wachstumsregulierenden Proteinen den unkontrollierten Eintritt in die S-Phase, was die Akkumulation des Tumorsuppressors p53 und somit die Induktion von Apoptose zur Folge hat. Diesen Prozessen wirkt E1B-55K mit verschiedenen Mechanismen entgegen. Zum einen bindet es an den Tumorsuppressoren p53 und hemmt somit dessen Transkriptionsaktivierungs- und Wachstumsunterdrückungsfunktion. Zum anderen assoziiert E1B-55K mit dem frühen Protein E4orf6, welche im Zusammenschluss mit den zellulären Proteinen Cullin 5, Elongin B und C sowie Rbx1 als E3-Ubiquitin-Ligase den proteasomalen Abbau von verschiedenen Wirtszellproteinen, unter anderem p53, regulieren. Weiterhin agiert E1B-55K als E3-SUMOLigase für p53 und fördert den nukleären Export des Proteins. Posttranslationale Modifikationen sind für die Multifunktionalität von E1B-55K von wesentlicher Bedeutung. Zu ihnen gehört unter anderem die SUMOylierung des N-Terminus von E1B-55K. In diesem Zusammenhang wurde schon gezeigt, dass viele Funktionen von E1B-55K durch seine SUMOylierung reguliert werden können. Das klassische SUMOylierungsmotiv ist allerdings nicht in HAdV-G52 E1B-55K konserviert. Zudem konnte in dieser E1B-Spezies kein nukleäres Exportsignal gefunden werden, wie es in HAdV-C5 E1B-55K vorzufinden ist und integraler Bestandteil seiner Funktion ist. In dieser Arbeit wurden primäre Babyratten-Nieren-Zellen mit Hilfe von lentiviralen Genvektoren transduziert, die die E1A-Region von HAdV-C5 oder die E1B-55K Region von HAdV-G52 codieren, und mittels verschiedener Experimente charakterisiert. Ziel dieser Arbeit war es, die Protein-DNA-Interaktionen des E1B-55K von HAdV-G52 mit p53 zu analysieren und verifizieren. Die stabile Expression an HAdV-G52 E1B-55K, dessen Assoziation mit p53 in nukleären Aggregaten und eine hohe Proliferationsrate der Zellen unter verschiedenen Serumbedingungen konnte erfolgreich nachgewiesen werden. Analysen der SUMOylierung zeigten, dass HAdV-G52 E1B-55K womöglich nicht durch diese post-translationale Modifikation beeinflusst wird. Im Kontext dieser Arbeit konnte zum ersten Mal die p53-bindende und repressive Aktivität von E1B-55K über die indirekte Bindung an regulatorische Genbereiche als Adenovirusspezies übergreifenden und hochkonservierten Mechanismus gezeigt werden.

The multifunctional E1B-55K-protein of the early transcription unit 1B of human adenovirus species C, type 5 (HAdV-C5) has an oncogenic potential and plays a fundamental role in the entire viral replication cycle. In cooperation with the viral protein E1A, it contributes to the complete transformation of primary mammalian cells. By interacting with several growthregulating proteins, E1A initiates the uncontrolled entry into the S-phase, which results in the accumulation of the tumor suppressor p53 and thus the induction of apoptosis. E1B-55K counteracts these processes with various mechanisms. On the one hand, it binds to the tumor suppressor p53 and thus inhibits its transcription activation and growth suppression function. On the other hand, E1B-55K associates with the early protein E4orf6, which, together with the cellular proteins Cullin 5, Elongin B and C and Rbx1 as E3 Ubiquitin-Ligase, regulate the proteasomal breakdown of various host cell proteins, including p53. E1B-55K also acts as E3-SUMO-ligase for p53 and promotes the nuclear export of the protein. Post-translational modifications are essential for the multifunctionality of E1B-55K. Among them is the SUMOylation of the N-terminus of E1B-55K. In this context, it has already been shown that many functions of E1B-55K can be regulated by its SUMOylation. However, the classic SUMOylation motif is not preserved in HAdV-G52 E1B-55K. In addition, no nuclear export signal could be found in this E1B species, as can be found in HAdV-C5 E1B-55K and is an integral part of its function. In this work primary baby rats kidney cells were transduced using lentiviral gene vectors encoding the E1A region of HAdV-C5 or the E1B-55K region of HAdV-G52 and characterized by various experiments. The aim of this work was to analyze and verify the protein-DNA interactions of the E1B-55K of HAdV-G52 with p53. The stable expression of HAdV-G52 E1B-55K, its association with p53 in nuclear aggregates and a high cell proliferation rate under various serum conditions were successfully demonstrated. Analysis of SUMOylation showed that HAdV-G52 E1B-55K may not be affected by this post-translational modification. In the context of this work the p53 binding and repressive activity of E1B-55K could be shown for the first time via the indirect binding to regulatory gene areas as a cross-adenovirus species-overlapping and highly conserved mechanism.