Medienoptimierung für die pDNA-Herstellung mit E. coli DH5 alpha und DH10 beta.

Abstract

Das Ziel dieser Arbeit war die Medienoptimierung für die Plasmid-DNA (pDNA) Herstellung mit den beiden Escherichia coli (E. coli) Stämmen DH5 alpha und DH10 beta. Hierfür wurde das pUC 19 Plasmid durch Elektroporation mit dem Elektroporator in die E. coli Stämme transformiert und von jedem Stamm fünf mikrobielle Dauerkulturen hergestellt. Anschließend wurde das Wachstumsverhalten von E. coli DH5 alpha und E. coli DH10 beta mit und ohne pUC 19 Plasmid im LB-Medium untersucht. Dafür wurde eine Batch-Kultivierung mit vorheriger Vorkultur im Schüttelkolben durchgeführt. Das LB-Medium wurde durch Zugabe von 8 g/L Glucoselösung, durch Zugabe von Aminosäuren wie Leucin, Arginin und Thiamin und durch Verwendung einer anderen LB-Medium Charge optimiert. Trotz des optimierten Mediums wuchsen die beiden E. coli Stämme nicht höher als auf eine optische Dichte (OD) von 4,00. Die Kultivierung im synthetischen Medium war für E. coli DH5 alpha, aber nicht für E. coli DH10 beta, möglich. Nach Literaturrecherche wurden die beiden Bakterienstämme im glycerinhaltigem Medium (Glycerolmedium) im Schüttelkolben kultiviert. Mit dem Glycerolmedium wurden optische Dichten bis zu einem Wert von 15 bei einer Kultivierungsdauer von 24 Stunden erreicht. Das pUC 19 Plasmid wurde durch alkalische Lyse mit einen Plasmid Mini Prep Kit aus der Suspension isoliert. Nach der Isolation wurde der Plasmidgehalt mit dem Nanodrop Spektralphotometer gemessen und die Varianz der Messmethode bestimmt. Durch ein Agarosegel wurden die einzelnen Isoformen des pUC 19 Plasmids sichtbar. Im weiteren Verlauf wurden die Unterschiede der fünf mikrobiellen Dauerkulturen der beiden E. coli Stämme untersucht. Dafür wurde eine Kultivierung, ein PlasmidPrep, eine Messung mit dem Nanodrop und ein Agarosegel durchgeführt. Jeweils eine mikrobielle Dauerkultur wies eine geringere Plasmidkonzentration auf als die anderen vier. Zum Abschluss wurde die Kultivierung von E. coli DH10 beta parallel in zwei Bioreaktoren durchgeführt. Nach der Kultivierung im Bioreaktor wurde zusätzlich die gravimetrische Biotrockenmassebestimmung durchgeführt und der Plasmidgehalt nach der Isolation mit dem PlasmidPrep mit dem Nanodrop Spektralphotometer bestimmt.