Anwendung des Design of Experiments-Ansatzes zur Untersuchung und Weiterentwicklung des Produktionsverfahrens des rekombinanten antimikrobiellen Peptids NK2-ALK in E. coli BL21 in einer Multifermenteranlage

Abstract

Die Entdeckung von Antibiotika markierte einen Meilenstein in der Medizin, indem sie Krankheiten wie Lungenentzündungen, Infektionen und Tuberkulose effektiv behandelten. Der exzessive Einsatz in der Medizin und Landwirtschaft führte zu einer Entstehung und Verbreitung von Antibiotikaresistenzen. Die Relevanz dieser globalen Krise wird immer deutlicher und stellt die moderne Medizin vor große Herausforderungen. Um dieser Aufgabe zu begegnen, werden verschiedene Strategien, wie „Antibiotic Stewardship“ oder die Suche nach neuen antimikrobiellen Wirkstoffen wie antimikrobiellen Peptiden (AMPs) verfolgt, die breite Wirksamkeit gegen verschiedene Mikroorganismen zeigen. Die AMPs sind Teil des angeborenen Immunsystems und unterscheiden sich in Ihrer Wirkungsweise von traditionellen Antibiotika, weswegen die bestehenden Antibiotikaresistenzen nicht gegen sie wirken. Das modifizierte AMP NK2-ALK wird als Fusionsprotein mit einer Onconase im Expressionsstamm E. coli BL21 (DE3) produziert. Die Kultivierung beginnt mit einer Batch-Phase, während der die Zellen fünf Stunden lang mit unbegrenzter Wachstumsrate unter Verwendung von Glucose als Substrat wachsen. Anschließend folgen zwei Fed-Batch Phasen mit einer Wachstumsrate von 0,25 h-1 bzw. 0,15 h-1 für fünf bzw. 14 h. Nachfolgend werden die Zellen in die 1 L Screeningreaktoren der Multifermenteranlage transferiert. In diesen wird der Einfluss von Hefeextrakt, Pepton und IPTG auf die Produktionsrate, unter Anwendung eines Design of Experiments (DOE), untersucht. Hierfür durchlaufen die Zellen in den Screeningreaktoren eine einstündige Fed-Batch Phase und werden anschließend mittels IPTG induziert. Die Produktionsphase dauert drei Stunden. Am Ende der Produktionsphase werden Proben genommen. Das Peptide wird mit Hilfe des Novagen® Kits extrahiert. Die Peptide Konzentration wird durch die Verwendung von Tricin-SDS-Page bestimmt. Die Auswertung des DOE geschieht durch die Verwendung der Modde Software. Es konnte ein geeignetes Model erzeugt werden. Dieses beschreibt einen negativen Einfluss von hohen Konzentrationen von Hefeextrakt und IPTG. Außerdem hat Pepton einen positiven Effekt auf die Produktausbeute. Die Hefeextrakt und Pepton Konzentration haben eine positive Interaktion, welche sich positiv auf die Produktausbeute auswirkt.