Etablierung eines Prozesses zur Kultivierung, Abtrennung und Zelllyse zur Untersuchung von Proteininteraktionen

Abstract

Die Hauptaufgabe bestand in der Entwicklung und Etablierung eines Zellkulturprozesses für die Produktion von Suspensionszellen (BA/F3 p210 und BA/F3 p210 eIF5A-2). Der Zellkultur-Prozess sollte die Durchführung von reproduzierbaren Kultivierungen ermöglichen. Im Vorfeld der Kultivierungsversuche, wurde das Wachstumsverhalten der entsprechenden Zelllinien mithilfe statischer Flaschenkultivierung untersucht, um mit den dabei ermittelten Werten eine Vergleichsbasis für später folgende Kultivierungen in den Rühr-Bioreaktoren zu schaffen. Die Vorversuche, die im Wesentlichen darauf abzielten eine geeignete Betriebsweise (Batch-Betrieb, Fed-Batch und kontinuierlicher Betrieb) für die Produktion der Zellen zu ermitteln, wurden in einem kleinen Rühr-Bioreaktor (Vario 1000, Hersteller: Medorex, Arbeitsvolumen ca. 300 ml) durchgeführt. Aus dem Vergleich der Kultivierungsergebnisse zwischen statischer und dynamischer Kultivierung der Zelllinien ergab sich, dass die Zellen in statischer Kultivierung das Medium besser ausnutzten und insgesamt höhere Lebendzelldichten hervorbrachten. Der Fed-Batch Betrieb brachte die höchste Lebendzelldichte, die in dynamischer Kultivierung ermittelt wurde, hervor. Jedoch war es bei dieser Betriebsweise nicht möglich den Zeitpunkt zu ermitteln, an dem sich die Zellen noch innerhalb der exponentiellen Wachstumsphase befunden haben. Beim kontinuierlichen Betrieb stellte sich heraus, dass die Zellen (BA/F3 p210 eIF5A-2) nicht lagerungsfähig waren und im Verlauf der Lagerung lysierten. Besonders im Hinblick auf die geforderte Reproduzierbarkeit der Kultivierungsergebnisse und die einfachere technische Umsetzung schien daher im Vergleich die Batch-Betriebsweise die geeignetere Betriebsweise zu sein. Für eine Maßstabsvergrößerung (Scale-up) stand ein 5-L Labor-Bioreaktor (Biostat B, Hersteller: Sartorius) zur Verfügung, der im Hauptversuch eingesetzt wurde. Insgesamt zeigte der Hauptversuch, dass sich der Batch-Betrieb für die reproduzierbare Produktion der geforderten Zellzahl eignete, auch wenn dabei die geforderte Zellzahl nicht ganz erreicht wurde. Nach dem Ernten der Zellen aus dem Hauptversuch wurden diese abzetrifugiert, gewaschen und lysiert. Das geklärte Lysat, mit den darin enthaltenen Zielproteinen wurde anschließend dem UKE übergeben.